新生大鼠胰腺干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及初步鑒定

張巨彪，蘇秀蘭，歐陽(yáng)曉暉※

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤外科，呼和浩特 010010； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

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新生大鼠胰腺干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及初步鑒定

張巨彪1，蘇秀蘭2，歐陽(yáng)曉暉1※

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤外科，呼和浩特 010010； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

摘要：目的探討分離、培養(yǎng)及初步鑒定新生大鼠胰腺干細(xì)胞的方法。方法取30只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)新生大鼠的胰腺組織，用完整胰腺膠原酶消化法分離胰島。以低糖改良Eagel培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于不同時(shí)期分別添加血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、白血病抑制因子、神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)因子B27、神經(jīng)元培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)因子N2等進(jìn)行培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征及生長(zhǎng)特性。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行巢蛋白(Nestin)及細(xì)胞角質(zhì)蛋白19(CK-19)檢測(cè)，并進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果①新生大鼠胰腺內(nèi)纖維組織少，體積小，完整胰腺膠原酶消化法簡(jiǎn)化了胰島分離步驟，減少了污染機(jī)會(huì)，有利于進(jìn)一步培養(yǎng)。②培養(yǎng)24 h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁,但貼壁細(xì)胞數(shù)量較少,改用無(wú)血清培養(yǎng)后,貼壁細(xì)胞快速生長(zhǎng)，10~15 d形成單層細(xì)胞匯集,細(xì)胞形態(tài)較一致。③培養(yǎng)所得細(xì)胞一直較多表達(dá)胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)CK-19的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。結(jié)論新生大鼠胰腺消化后，獲得的細(xì)胞于不同時(shí)期表達(dá)胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin、CK-19。

關(guān)鍵詞：胰腺干細(xì)胞；移植；細(xì)胞分離；細(xì)胞培養(yǎng)；大鼠

干細(xì)胞是體內(nèi)存在的特殊細(xì)胞，既有自我更新和不斷增生的能力，又有多向分化的潛能，這種特點(diǎn)使其成為獲得大量胰島β細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞,只要掌握了胰腺干細(xì)胞的特異標(biāo)志、轉(zhuǎn)化調(diào)控機(jī)制、培養(yǎng)及分離技術(shù)就可以體外操縱干細(xì)胞，大量擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化，最后得到胰島樣細(xì)胞[1-2]。

盡管胰腺干細(xì)胞的研究及移植已有成功的報(bào)道，但是胰腺干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)為靶細(xì)胞的研究，乃至用于治療糖尿病的研究仍然存在一些問(wèn)題，尚未能用于臨床，因此需要進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新生大鼠胰腺組織中胰腺干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和初步鑒定等方面進(jìn)行研究，目的是建立一套比較有效的技術(shù)和方法，進(jìn)而獲得單一性和富集度均較高的胰腺干細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料30只新生無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)大鼠(2~4 d)購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量220～280 g，飼養(yǎng)室內(nèi)氨濃度<20 g/L，相對(duì)濕度為40%～70%，室溫18～25 ℃，普通飼料喂養(yǎng)，飼水自由，實(shí)驗(yàn)前1 h領(lǐng)取。

1.2方法

1.2.1含血清培養(yǎng)液的制備取改良型Eagel培養(yǎng)液，加10%胎牛血清,100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，加β-巰基乙醇終濃度為 71.5 μmol/L,丙酮酸鈉終濃度1 mmol/L，HEPES終濃度為 1 mmol/L，加入多鳥(niǎo)氨酸終濃度為10 μg/mL,牛纖維連接蛋白終濃度為2 μg/mL，刀豆素A終濃度為 1 μg/mL，過(guò)濾除菌,4 ℃冰箱保存。

1.2.2無(wú)血清培養(yǎng)液的制備取改良型Eagel培養(yǎng)液，加100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素，羥乙基哌嗪乙磺酸終濃度為1 mmol/L，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子各 20 ng/mL，1400 U/mL白細(xì)胞抑制因子，2%神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)因子B27、1%神經(jīng)元培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)因子N2添加劑，過(guò)濾除菌,4 ℃冰箱保存。

6 d后(大約換液3次)，用不含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3新生大鼠胰腺干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)無(wú)菌條件下完全游離胰腺后取出，放入4 ℃ D-Hank′s(無(wú)鈣鎂離子的Hank′s液)液中，再放入50 mL的消化瓶中，加入膠原酶6 mL，封瓶后放入37 ℃恒溫水浴中消化12 min，立即加入4 ℃ D-Hank′s液40 mL中，用吸管反復(fù)吹打至胰腺團(tuán)塊消失，自然沉降，棄去上清液，反復(fù)吹打3次，收集沉降的消化物。取D-Hank′s液稀釋后的胰島制備物3 mL,加入配制好的雙硫腙液5 μL,混勻后靜置3 min,倒置相差顯微鏡下觀察。培養(yǎng)瓶中加入5 mL含血清培養(yǎng)液。為初步鑒定細(xì)胞，培養(yǎng)板的3個(gè)孔中預(yù)先放入無(wú)菌處理后的蓋玻片，每孔加入1 mL含血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)板均過(guò)夜后使用。將分離好的胰島制備物加入配制好的8 mL含血清培養(yǎng)液，充分吹打均勻，于培養(yǎng)板的3個(gè)孔中每孔加入1 mL，使每孔中共含培養(yǎng)液2 mL，將剩余的制備物平均放入兩個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

72 h后可見(jiàn)有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但胰島細(xì)胞不貼壁，棄去不貼壁細(xì)胞及胰島，換用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，每48小時(shí)換液1次，3次后，換用不含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈較快速度生長(zhǎng),10~15 d可形成單層細(xì)胞匯合。

10~15 d后，細(xì)胞約長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶70%進(jìn)行傳代，用 0.05%胰酶消化5 min，吹打均勻后接種在含血清培養(yǎng)液中，重復(fù)前述培養(yǎng)。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞培養(yǎng)同前，于培養(yǎng)的第4、8、12日取出細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行初步鑒定。將培養(yǎng)液棄去，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，以4%多聚甲醛37 ℃固定20 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，加50 μL過(guò)氧化物酶阻斷液，室溫孵育10 min,PBS洗滌3次，加50 μL正常動(dòng)物非免疫血清，室溫孵育5 min,PBS洗滌3次，Nestin加入50 μL 1∶100稀釋的Nestin，細(xì)胞角質(zhì)蛋白19(cyto-keratoprotein-19,CK-19)的檢測(cè)加入50 μL 1∶100稀釋的CK-19，室溫孵育90 min,PBS洗滌3次，加入即用型、生物素標(biāo)記的廣譜型二抗，室溫孵育10 min,PBS洗滌3次，加入50 μL鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育 10 min,PBS洗滌3次，加入新配制的100 μL過(guò)氧化物酶反應(yīng)底物3,3′-二氨基聯(lián)苯胺，室溫下10 min，鏡下觀察,PBS洗滌，中止反應(yīng),以上PBS洗滌每次5 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化3 s，自來(lái)水沖洗5 min，浸水，藍(lán)化,空白對(duì)照使用 PBS替代一抗，其余條件相同,結(jié)果觀察:陽(yáng)性為細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色；陰性為胞質(zhì)不著色。細(xì)胞計(jì)數(shù)法:在倒置相差顯微鏡下放大100倍觀察，計(jì)數(shù)四角大方格中的細(xì)胞。

2結(jié)果

2.1新生大鼠胰腺干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1新生大鼠胰腺干細(xì)胞的體外分離結(jié)果新生大鼠完整胰腺經(jīng)膠原酶消化后，可見(jiàn)胰腺組織散落呈細(xì)顆粒狀，終止消化后，反復(fù)吹打，組織完全散開(kāi)，肉眼見(jiàn)大塊組織消失，呈均勻一致的細(xì)顆粒樣懸液，經(jīng)3次沉降后即可獲得胰島制備物。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞團(tuán)及散在的細(xì)胞，雙硫腙染色后可見(jiàn)亮紅色的胰島細(xì)胞(圖1，見(jiàn)封三)。

2.1.2新生大鼠胰腺干細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)72 h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁,但貼壁細(xì)胞形態(tài)不一,數(shù)量較少,改用無(wú)血清培養(yǎng)48 h后,貼壁細(xì)胞數(shù)量增加，混有少量成纖維細(xì)胞，約達(dá)培養(yǎng)板面積的5%(圖2，見(jiàn)封三)。此時(shí)棄去不貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，換用不含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液后，成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈較快速度生長(zhǎng),10~15 d可形成單層細(xì)胞匯合(圖3，見(jiàn)封三)。

2.1.3新生大鼠胰腺干細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)中，胰腺干細(xì)胞最多可傳至第3代，之后，細(xì)胞分裂開(kāi)始停滯，活力逐漸降低，最終碎裂、死亡。

2.2新生大鼠胰腺干細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果培養(yǎng)的第4、8、12日取出細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Nestin與CK-19，其中CK-19與Nestin的抗體濃度均為1∶100。在培養(yǎng)第4日可見(jiàn)一些多角形上皮樣細(xì)胞，單核，呈附壁生長(zhǎng)，Nestin表達(dá)陽(yáng)性，胞質(zhì)染成棕黃色(圖4，見(jiàn)封三)，成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)的細(xì)胞散在分布，形態(tài)不規(guī)則，多為長(zhǎng)梭形，Nestin與CK-19染色均呈陰性反應(yīng)。第8日后可見(jiàn)培養(yǎng)細(xì)胞中仍多數(shù)表達(dá)Nestin(圖5，見(jiàn)封三)，表達(dá)CK-19的陽(yáng)性細(xì)胞比例開(kāi)始增加(圖6，見(jiàn)封三)，胞質(zhì)染成棕黃色，空白對(duì)照陰性。第12日時(shí)，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CK-19(圖7，見(jiàn)封三)與Nestin，成纖維細(xì)胞樣逐漸減少，空白對(duì)照仍為陰性。

3討論

研究顯示，胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)可獲得胰島細(xì)胞，并能使糖尿病動(dòng)物模型血糖恢復(fù)正常；胰腺內(nèi)也存在Nestin陽(yáng)性細(xì)胞，體外分離和培養(yǎng)后可形成胰島樣結(jié)構(gòu)[3-4]。新生大鼠胰腺內(nèi)纖維組織少，采用完整胰腺消化，組織消化完全，對(duì)胰島損傷較小，可獲得完好的胰島，滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求，省略了胰腺組織剪碎的過(guò)程，減少了組織污染機(jī)會(huì)，有利于組織培養(yǎng)[5]。

血清中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)細(xì)胞有去分化作用,影響細(xì)胞功能，血清還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),造成優(yōu)勢(shì)效應(yīng)而抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究先用含血清培養(yǎng)液,使胰腺細(xì)胞盡快貼壁,貼壁后改為含多種生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液，換液3次后，改用不含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液，達(dá)到控制成纖維細(xì)胞繁殖、促進(jìn)胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

研究認(rèn)為，胰腺干細(xì)胞體外擴(kuò)增、培養(yǎng)時(shí)均呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為多角形上皮樣[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類(lèi)似，新生大鼠胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，呈克隆性生長(zhǎng)，貼璧時(shí)，呈多角形上皮樣，核為圓形，單、雙或多核仁。胰腺干細(xì)胞特異性標(biāo)志物還沒(méi)有最終完全確定，目前較為公認(rèn)的特異性標(biāo)志物有以下幾種[7-8]：Nestin、CK-19、胰腸同源域因子1、神經(jīng)原因子3、波形蛋白等。

本研究為確定新生大鼠胰腺干細(xì)胞的表達(dá)特征，參照多種研究結(jié)果，在免疫細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中選用Nestin和CK-19標(biāo)志物的抗體對(duì)胰腺干細(xì)胞抗原進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，共表達(dá)Nestin與CK-19的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。

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張巨彪，蘇秀蘭，歐陽(yáng)曉暉

新生大鼠胰腺干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及初步鑒定

圖1新生大鼠胰島細(xì)胞分離后在倒置顯微鏡下被染成紅色(雙流腙×100)

圖2新生大鼠胰島細(xì)胞分離后培養(yǎng)72 h后在倒置相差顯微鏡下形成的貼壁細(xì)胞(雙流腙染色×100)

圖3新生大鼠胰島細(xì)胞分離后培養(yǎng)10 d后在倒置相差顯微鏡下形成的貼壁細(xì)胞(雙流腙染色×40)

圖4培養(yǎng)4 d后的貼壁細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下Nestin呈陽(yáng)性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×100)

圖5培養(yǎng)8 d后的貼壁細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下Nestin呈陽(yáng)性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×100)

圖6培養(yǎng)8 d后的貼壁細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下CK-19呈陽(yáng)性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×100)

圖7培養(yǎng)12 d后的貼壁細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下CK-19呈陽(yáng)性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×40)

Isolation，Cultivation and Identification of Pancreatic Stem Cells from Newborn RatsZHANGJu-biao1,SUXiu-lan2,OUYANGXiao-hui1. (1.DepartmentofSurgicalOncology,InnerMongoliaPeople′sHospital,Hohhot010010,China; 2.CentralLoaboratory,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010010,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the method of isolation,cultivation and identification of pancreatic stem cells in newborn rats.MethodsA total of 30 newborn rats were bought from Experimental Animal Center,Inner Mongolia University.Get the rats 1 h before experiments.The whole pancreas of newborn rats were digested with collagenase,and cultivated with the basic Eagel culture solution modified with low.Serum,bFGF,EGF,ITS,LIF,N2,B27 were added to culture solution during different phases,the digested tissue fragments were cultured.The whole formation process of new pancreatic stem cells was observed under the inverted phase contrast microscope.The expression of Nestin and CK-19 was tested using immunocytochemical method.Results①Because there was little fibrous tissue in newborn rat,its pancreas and the volume of pancreas were tiny,the opportunity of contamination was greatly reduced，so as to make further experiments.②After 24 hours,some cells adhered to the surface of the culture plates,but the number of them was small,then we removed the liquid, and added medium of free serum,the number of them increased obviously,10-15 days later,a newly formed monolayer of cells could be observed, their shapes were uniform.③During the cultivation period,the cells came from the pancreas of newborn rats expressed large amount of Nestin,and as the cultivation time prolonged,the expression of CK-19 increased.ConclusionAfter digestion of newborn rat′s pancreas, the cells express Nestin and CK-19, which are the markers of the expression of pancreatic stem cells,during different periods.

Key words：Pancreatic stem cells; Transplant; Cells isolation; Cells cultivation; Rat

收稿日期：2013-07-29修回日期：2014-10-31編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.047

中圖分類(lèi)號(hào)：R617

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)02-0315-02