檢測鴨1 型甲肝病毒抗體間接ELISA 方法的建立

劉 偉，傅秋玲，黃 瑜，傅光華，陳 珍，陳紅梅，程龍飛，萬春和，施少華，林建生

（1.福建農林大學動物科學學院，福建 福州350002 ；2.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）感染雛鴨引起的一種傳播迅速的高度致死性傳染病，以角弓反張和肝臟腫大、出血為主要臨床特征。最初將DHV 分為3 個血清型，分別是1 型、2 型、3 型鴨肝炎病毒（DHV），但最新研究表明，傳統(tǒng)的血清2型和3 型均屬星狀病毒[1]，不宜將它們稱為DHV的2 個血清型。根據(jù)2008 年后的分類，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，稱為鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）。目前發(fā)現(xiàn)，DHAV 包含3 種基因型(或血清型)，分別命名為DHAV-1、2 型和3 型[2]，其中DHAV-1 型即為傳統(tǒng)的血清1 型鴨肝炎病毒[3]，DHAV-2 型和DHAV-3型分別為近來報道的臺灣新型[4]和韓國新型[5]。

2011 年，我國福建、浙江、廣東等省的部分養(yǎng)鴨場10～30 日齡雛番鴨、半番鴨發(fā)生以胰腺泛黃、出血（俗稱胰腺炎）為特征的疫病，其發(fā)病率和病死率分別達10%～30%、25%～40%，經(jīng)實驗室的病原學研究確定其病原為鴨1 型甲肝病毒（DHAV-1）[6-7]，但其在易感宿主、組織嗜性和特征肉眼病變上均不同于經(jīng)典的肝炎型鴨1 型甲肝病毒。為區(qū)別起見，將其暫定為胰腺炎型DHAV-1。我們經(jīng)血清交叉中和試驗等進一步研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎型DHAV-1 與肝炎型DHAV-1 間的抗原相關值（R）為0.62，表明胰腺炎型DHAV-1 與經(jīng)典的肝炎型DHAV-1 相比其抗原性發(fā)生了較大變異，定名為鴨1 型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）（見另文報道）。

國內外尚未建立檢測鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，因此建立一種快速靈敏的抗體檢測方法十分必要。本研究以純化、濃縮的鴨1 型甲肝病毒亞型為包被抗原，通過優(yōu)化反應條件，建立了可檢測鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，且具有特異性強、重復性好、敏感性高等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 病毒株 MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒（即鴨1 型甲肝病毒亞型）由福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑 羊抗鴨IgG-HRP，購自KPL 公司；TMB 顯色液，購自武漢博士德公司；酶標板，購自Corning 公司。

1.3 間接ELISA 檢測方法的建立

1.3.1 病毒濃縮液的制備 以鴨胚成纖維細胞蝕斑純化的MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒經(jīng)尿囊腔途徑接種12 日齡鴨胚，37 ℃溫箱孵化，逐日照蛋，棄去24 h 內死胚，無菌收取48～96 h 內死亡鴨胚的尿囊液。8 000 r/min 離心2 h，取上清，50 000 r/min 離心3 h，棄上清，取沉淀以PBS 懸浮，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化濃縮病毒。

1.3.2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法將純化的病毒濃縮液用pH 值9.6 的碳酸鹽緩沖液按照1∶200～1∶3 200 倍比稀釋，每個稀釋度包被一橫行，每孔100 μL，37 ℃作用1 h 后，4 ℃包被過夜（14 h）；倒空液體，PBST 洗滌3 次，5 min/次，甩干；10%脫脂乳37 ℃封閉2 h；棄去脫脂乳，洗滌同上，甩干；陽性血清和陰性血清分別按照1∶50～1∶400 的倍比稀釋，每個稀釋度加一縱行，每孔加100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板同上，甩干；加入羊抗鴨酶標抗體（1∶500），100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；洗板同上，甩干；每孔加入100 μL TMB 顯色液室溫避光顯色10 min；每孔加入100 μL 0.5 mol/L 硫酸終止顯色；酶標儀測定OD450nm 值，P/N 比值最大時為最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.3.3 抗原最佳包被條件的確定 采用最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度，分別以37 ℃1 h 后4 ℃過夜（14 h）、37 ℃2 h、4 ℃過夜（14 h）3 種不同的包被條件包被，其他同上，確定抗原的最佳包被條件。

1.3.4 最佳血清工作時間的確定 血清分別以37 ℃45 min、60 min、90 min 過夜（14 h）3 種不同的孵育時間進行孵育，其他同上，測定確定最佳血清工作時間。

1.3.5 酶標二抗最佳工作時間的確定 羊抗鴨酶標二抗分別作用30、45、60 min 后進行測定，以確定酶標二抗的最佳工作時間。

1.3.6 臨界值的確定 取32 份DHAV-1 陰性鴨血清，按照已建立的檢測方法進行測定，并將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，求出OD450nm 平均值和標準差SD。根據(jù)統(tǒng)計學原理，OD450nm≥平均OD450nm值+3 SD 時，判為陽性。OD450nm＜平均OD450nm值+3 SD 時，判為陰性。

1.3.7 特異性試驗 以建立的分別檢測鴨抗H9N2 亞型禽流感病毒、鴨瘟病毒、水禽新城疫病毒、鴨坦布蘇病毒、雛番鴨細小病毒、鴨呼腸孤病毒的6 種病毒的高免陽性血清和經(jīng)典肝炎型鴨1型甲肝病毒高免陽性血清，同時設陽性血清對照，檢測其特異性。

1.3.8 重復性試驗 （1）批內重復試驗：用同批次制備病毒濃縮液，選取6 份不同抗體水平的陽性血清樣品及1 份陰性血清樣品，分別于第1、2、3 天進行批內重復檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計學分析；（2）批間重復試驗：用3 份不同批次制備的胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒濃縮液，選取6 份陽性血清樣品及1 份陰性血清樣品，進行批間重復檢測，并對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

1.3.9 敏感性試驗 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒高免陽性血清做1∶800～1∶25 600 倍比稀釋，進行間接ELISA。

1.3.10 符合率試驗 以建立的試驗方法對經(jīng)過血清中和試驗檢驗為陽性的12 份鴨血清和檢驗為陰性的8 份鴨血清進行檢測，比較間接ELISA試驗方法和血清中和試驗的符合率。

2 結果與分析

2.1 純化病毒的蛋白定量 將純化的全病毒用Thermo Scientific NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計測定蛋白濃度，檢測結果顯示，蛋白質濃度為2 502 μg/mL。

2.2 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 方陣滴定法結果顯示，當純化抗原的稀釋濃度為1∶800（即每孔抗原包被量為0.3128 μg），血清的稀釋度為1∶200 時，陽性血清的OD450nm 值為1.120，接近1，陽性與陰性OD450nm 比值最大為8.549。因此，抗原的最佳包被濃度為0.3128 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶200（表1）。

表1 抗原和血清最適稀釋度測定

2.3 抗原最佳包被條件的確定37 ℃1 h 后4 ℃包被過夜P/N 值最高，包被效果較好（表2）。

表2 抗原最佳包被條件的確定

2.4 最佳血清工作時間的確定 當鴨血清作用時間為60 min 時，P/N 值最高，靈敏度好（表3）。

表3 最佳血清工作時間的確定

2.5 酶標二抗最佳工作時間的確定 羊抗鴨IgG-HRP 二抗37 ℃作用45 min 時P/N 比值最大（表4）。

表4 酶標二抗最佳工作時間的確定

2.6 臨界值的確定 對32 份陰性血清的檢測結果進行統(tǒng)計學分析，計算其平均OD450nm 值為0.139，標準偏差（SD）為0.0128，根據(jù)判定標準，即當OD450nm≥0.177時判為陽性，OD450nm＜0.177時判為陰性。

2.7 特異性試驗 用上述已知的病毒高免陽性血清進行ELISA 試驗，其OD450nm 值均小于陰陽性臨界值，均呈陰性；而經(jīng)典肝炎型DHAV-1 陽性血清和胰腺炎型DHAV-1 陽性血清的OD450nm 值分別為0.855 和1.167，均明顯高于陰陽性臨界值，即均為陽性，表明該方法特異性強。

2.8 重復性試驗 間接ELISA 重復性試驗結果顯示，批內重復性試驗的變異系數(shù)為1.5%～5.1%，批間重復性試驗的變異系數(shù)為3.2%～5.3%，均小于10%，結果表明該間接ELISA方法重復性較好（表5）。

表5 間接ELIS A 批內重復試驗和批間重復試驗結果

2.9 敏感性試驗 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒陽性血清分別做1∶800～1∶12 800 倍比稀釋，進行間接ELISA。結果顯示，1∶6 400 稀釋后仍可檢測為陽性，而1:12 800 稀釋的陽性血清檢測結果低于0.177，無法判定（表6）。

2.10 符合率試驗 對經(jīng)血清中和試驗檢測為陽性的12 份血清樣品和檢測為陰性的8 份血清樣品，以建立的間接ELISA 方法分別進行檢測，結果與中和試驗檢測結果的陽性符合率、陰性符合率均為100%。

表6 間接ELIS A 敏感性試驗結果

3 小結

本研究建立了檢測胰腺炎型DHAV-1，即鴨1型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）抗體的間接ELISA方法，并提出了判定標準。檢測雛鴨體內鴨1 型甲肝病毒亞型的抗體，有較強的特異性和準確性，能快速檢測抗體，從而判斷是否存在該病毒的感染。該方法的建立為DHAV-1a 感染的預防和控制提供了一種新的檢測方法，既適宜于鴨群中大批量鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的監(jiān)測，還可用于鴨群接種疫苗后血清抗體消長規(guī)律的測定及對疫苗免疫效果的評價。

該間接ELISA 方法雖有簡便、快速、特異性強等優(yōu)點，但仍存在抗原制備較復雜、制備要求高等不足，且不能區(qū)別胰腺炎型DHAV-1（即DHAV-1a）抗體與經(jīng)典肝炎型DHAV-1 抗體，今后將進一步研制單抗，以期建立可鑒別兩者抗體的血清學方法。

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