甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒雙重熒光定量PCR方法的建立及應用

張　磊，魯淑婷，李玉龍，黃洲風*

(1.河南省人民醫(yī)院 血液病研究所，河南 鄭州450003；2.鄭州市第一人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州450004)

甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒雙重熒光定量PCR方法的建立及應用

張磊1，魯淑婷2，李玉龍1，黃洲風1*

(1.河南省人民醫(yī)院 血液病研究所，河南 鄭州450003；2.鄭州市第一人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州450004)

摘要：目的建立甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)的雙重熒光定量PCR檢測方法并應用于臨床樣本的檢測。方法根據(jù)參考文獻分別選取HAV以及HEV基因組的保守區(qū)域設計合成特異性引物和探針，從而建立并優(yōu)化雙重熒光定量PCR反應體系，之后評價反應體系的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。結果本研究建立的HAV和HEV雙重熒光定量PCR技術應用于檢測HAV核酸時檢測極限可以達到1個拷貝/反應，對同一樣品重復測定5次獲得的Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為1.5%，同時該體系檢測HEV的最低檢測極限也達到10個拷貝/反應，重復測試5次后Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為2.6%，臨床樣本測試結果顯示該體系能夠對甲型肝炎和戊型肝炎臨床樣本中的病毒進行定量。結論本研究成功建立了HAV和HEV雙重熒光定量PCR檢測方法，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以同時準確定量HAV和HEV，為這兩種病毒的分子病原學診斷提供了一種更加快速的手段。

關鍵詞：甲型肝炎病毒；戊型肝炎病毒；雙重熒光定量PCR；敏感性

(ChinJLabDiagn,2015,19:2063)

甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)均是能夠引起急性肝炎暴發(fā)的致病因子，歷史上都曾多次造成疾病流行，帶來過很嚴峻的公共衛(wèi)生問題[1]。雖然在分類學上這兩個病毒相去甚遠，但從流行病學的角度來看，HAV和HEV的分布均具有明顯的區(qū)域性特征，在發(fā)展中國家流行較廣，尤其是衛(wèi)生條件較差的區(qū)域，這在很大程度上應該歸因于兩種病毒具有相似的傳播途徑，都是通過糞口途徑傳播，事實證明：直接接觸感染者的排泄物或排泄物污染過的水、土壤甚至接觸感染者存在的環(huán)境都有可能造成HAV和HEV感染，因此對于排泄物中以及環(huán)境中和蔬菜食品中的病毒檢測便顯得尤其重要，然而，這兩種病毒都很難進行細胞培養(yǎng)，或可以培養(yǎng)但不出現(xiàn)明顯的細胞病理效應，因此對HAV和HEV的檢測便主要依賴于核酸的檢測，目前實時熒光定量PCR技術以其靈敏度高，檢測速度快，特異性強等優(yōu)點，已在很多種病原體的核酸定量檢測中得到了廣泛的應用，實時熒光定量PCR技術又主要分為SYBR Green染料技術和TaqMan探針技術兩種，兩種方法相比，TaqMan探針技術具有更好的特異性，且花費更低、易于設計，所以本研究探索建立了基于TaqMan技術的HAV和HEV雙重熒光定量PCR檢測方法。

1材料與方法

1.1血清樣品和對照病毒株來源用于制備HAV和HEV定量標準品的質粒模板由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所饋贈。檢驗反應體系特異性時用到的麻疹病毒核酸(RNA)、脊髓灰質炎病毒核酸(RNA)、風疹病毒核酸(RNA)、呼吸道合胞病毒核酸(RNA)、流感病毒核酸(RNA)、輪狀病毒核酸(RNA)、諾如病毒核酸(RNA)、星狀病毒核酸(RNA)以及腸道腺病毒核酸(DNA)來自于中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，所有RNA儲存于-70℃超低溫冰箱。10份甲型肝炎患者和10份戊型肝炎患者的血清樣本由河南省人民醫(yī)院感染科收集饋贈，保存于-20℃。

1.2引物和探針的設計合成根據(jù)參考文獻[2-5]確定HAV的擴增靶點位于病毒基因組的5′-NCR，選取合適的引物和探針，探針5′端標記FAM熒光報告基團，而HEV的擴增區(qū)域位于HEV ORF2區(qū)，為實現(xiàn)單管雙重的擴增效果，HEV探針5′端標記Cy5熒光報告基團，本研究中用到的所有引物和探針均委托寶生物工程(大連)有限公司合成，序列名稱和標記如表1所示。

表1　HAV和HEV雙重實時熒光定量PCR的引物和探針

1.3標準品的構建和制備以帶有HAV和HEV擴增靶序列的質粒作為轉錄模板，使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7(Promega)試劑盒，在T7 RNA聚合酶的作用下，分別轉錄生成HAV定量和HEV定量用的RNA標準品，之后加入Dnase RQI 37℃作用15 min降解DNA模板，RNA產(chǎn)物經(jīng)純化后溶于DEPC水，使用紫外分光光度計(Nanodrop)測定其濃度并根據(jù)相對分子量計算其拷貝數(shù)濃度，最終倍比稀釋成1×107-1×100拷貝/μl作為HAV和HEV熒光定量PCR實驗的標準品。

1.4臨床血清樣本中病毒RNA的提取從臨床血清樣本中提取病毒RNA采用QIAamp Viral RNA mini kit(Qiagen)，嚴格按照試劑盒說明書操作，提取出的HAV和HEV RNA洗脫于60 μl DEPC處理的水中。

1.5HAV HEV雙重實時熒光定量PCR本研究使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (TaKaRa) 在ABI Real-time PCR 7500儀器上進行熒光定量檢測，反應體系配制如下：2× one step RT-PCR Buffer III 12.5 μl,TaKaRa ExTaqTMHS 0.5μl,PrimeScriptTMRT Enzyme Mix II 0.5 μl,ROX Reference Dye II 0.5 μl，反應后得到樣本的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)，根據(jù)標準曲線計算樣品中含有的RNA拷貝數(shù)。

1.6確定雙重熒光定量PCR的最優(yōu)反應條件以制備的HAV和HEV RNA標準品作為模板，分別選用0.2 μM、0.4 μM和0.6 μM濃度的熒光探針以及0.2 μmol/L、0.4 μmol/L和0.6 μmol/L的上下游引物濃度進行預實驗，通過比較不同濃度的上下游引物及探針組合優(yōu)化本實驗體系，最終通過矩陣法優(yōu)選出最佳工作濃度，另外，對雙重實時熒光定量PCR的反應條件進行摸索，確定最優(yōu)變性溫度和退火溫度。

2結果

2.1最適反應條件的確定以25 μl為反應總體積，通過對不同濃度的引物、Taq-Man探針以及退火溫度的篩選、比較和優(yōu)化，確定最佳反應體系為：HAV和HEV熒光標記探針濃度為0.2μM、上下游引物分別為0.4 μmol/L，最適的退火溫度確定為60℃，因此雙重熒光定量PCR最終的反應條件設置如下：42℃30 min，95℃10 sec，95℃5 sec，60℃34 sec，共40個循環(huán)。

2.2標準曲線的建立以體外轉錄并純化后獲得的HAV和HEV RNA分子拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(X)，以Ct值為縱坐標(Y)，建立HAV和HEV實時熒光定量PCR的標準曲線。當標準品的拷貝數(shù)在100-107之間時，HAV熒光定量PCR標準曲線呈良好的線性，斜率為-3.287，相關系數(shù)R2=0.999，最低檢測極限為1個拷貝/反應，而HEV熒光定量PCR標準曲線的斜率為-3.829，最低檢測極限為10個拷貝/反應。

2.3HAV HEV雙重實時熒光定量PCR的靈敏度和特異性檢測以系列稀釋的HAV和HEV RNA標準品作為反應模板，分別評估該實時熒光定量PCR體系檢測HAV核酸和HEV核酸的靈敏程度，確定HAV和HEV的最低檢測極限分別為1個拷貝/反應和10個拷貝/反應。當使用該反應體系檢測麻疹病毒核酸(RNA)、脊髓灰質炎病毒核酸(RNA)、風疹病毒核酸(RNA)、呼吸道合胞病毒核酸(RNA)、流感病毒核酸(RNA)、輪狀病毒核酸(RNA)、諾如病毒核酸(RNA)、星狀病毒核酸(RNA)以及腸道腺病毒核酸(DNA)時， 均未檢測出陽性擴增信號，表明該系統(tǒng)具有良好的特異性。

2.4HAV HEV雙重實時熒光定量PCR的重復性檢測為了評價熒光定量PCR體系檢測HAV核酸和HEV核酸的穩(wěn)定性，分別使用6個濃度(101-106拷貝/反應)的HAV RNA標準品和HEV RNA標準品作為模板進行平行的5次重復測試。結果如表2所示，檢測不同稀釋度的HAV時Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為1.5%，而測試HEV的變異系數(shù)(CV)最大為2.6%，說明所建立的雙重實時熒光定量PCR檢測體系具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

表2　HAV HEV雙重實時熒光定量PCR的可重復性

2.5HAV HEV雙重實時熒光定量PCR檢測體系的應用通過本研究中建立的HAV HEV雙重實時熒光定量PCR檢測體系檢測了10份處于急性期的甲型肝炎患者的血清樣本和10份戊型肝炎患者的血清樣本，結果均為陽性，檢出率100%，根據(jù)標準曲線計算得到臨床樣本中HAV RNA拷貝數(shù)范圍從1.57×103拷貝/ml到6.92×107拷貝/ml而戊型肝炎患者的臨床樣本中HEV RNA拷貝數(shù)范圍從5.44×105拷貝/ml到2.19×107拷貝/ml。

3討論

一套成功的實時熒光定量PCR技術的建立主要取決于探針和引物的選擇，需要對兩種病毒的基因結構有比較深入的了解，HAV的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，全長在7470-7478bp之間，僅含有一個開放讀碼框架[6]，由于不同的HAV分離株核酸序列高度同源，設計HAV實時熒光定量PCR的引物和探針相對容易，但HEV卻型別眾多，文獻報道至少有4個不同的HEV基因型，各基因型之間核苷酸序列同源性僅為74%-76%[7]，給核酸檢測帶來一定的難度，而且要把與HAV和HEV的檢測體系整合，建立同一溫度和條件下的雙重熒光定量PCR也對引物和探針的設計提出了較高的要求，所以本研究參考了前人對于HAV和HEV核酸定量的研究，選擇了合適的引物和探針，并對引物探針的濃度、變性溫度、退火溫度等反應條件進行了反復的摸索，最終確立95℃變性、60℃退火是同時擴增HAV和HEV的最適反應條件。

經(jīng)過對體外制備的HAV RNA標準品、HEV RNA標準品以及其它多種病原體核酸的檢測，發(fā)現(xiàn)本研究中建立的HAV HEV雙重實時熒光定量PCR檢測體系不僅特異性高，而且非常敏感，其中對于HAV核酸的檢測極限可以達到1個拷貝/反應，高于國內外類似方法的靈敏程度，而重復性實驗表明，同一稀釋度重復5次測量Ct值的變異系數(shù)僅為1.5%和2.6%，說明此反應具有很好的穩(wěn)定性，可以進行可靠、穩(wěn)定的檢測。

臨床樣本的測試結果顯示，本研究建立的HAV HEV雙重實時熒光定量PCR檢測體系能夠從處于急性期的甲型肝炎患者和戊型肝炎患者的血清樣本中檢測出HAV和HEV核酸，這預示著該體系可用于甲型肝炎和戊型肝炎早期的臨床診斷，除此之外，由于本方法快速、準確、簡便的特點，所以對急性肝炎暴發(fā)的預防和控制以及流行病學監(jiān)測調查也具有十分重要的實用價值。

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Development and Application of Multiplex Real-time PCR Assay for Hepatitis A Virus and Hepatitis E Virus DetectionZHANGLei1,LUShu-ting2,LIYu-long1,etal.(1.HematonosisResearchInstituteofHenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;2.LaboratoryDepartmentoftheFirstPeople'sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450004,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a multiplex real-time PCR assay for hepatitis A virus and hepatitis E virus clinical samples detection.MethodsThe specific primers and probes in the conserved region of HAV and HEV genome were designed according to the references.Therefore,HAV-HEV multiplex real-time PCR was established and optimization followed by the evaluation of specificity,sensitivity and reproducibility.ResultsThe detection limit could up to 1 copy each reaction when HAV-HEV multiplex real-time PCR was applied for HAV detection.The same dilution of the RNA standard was analyzed in five times in parallel and the maximum coefficient of variation (CV) of Ct values was 1.5%.The detection limit was 10 copies each reaction in HEV sensitivity evaluation and the maximum CV of Ct values was 2.6% in reproducibility analysis.Clinical tests suggested HAV-HEV multiplex real-time PCR assay was able to quantify HAV and HEV in clinical samples.ConclusionThe HAV-HEV multiplex real-time PCR was established successfully.This detection method was sensitive,stable and it could be used for simultaneous quantification of HAV and HEV.It provided another rapid way for pathogenic diagnosis of these two viruses.

Key words:Hepatitis A virus;Hepatitis E virus;Multiplex real-time PCR;Sensitivity

(收稿日期：2015-01-13)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R575.1

文章編號：1007-4287(2015)12-2063-04

*通訊作者