柱前衍生高效液相色譜測(cè)定糖化血紅蛋白

王冬環(huán)，周偉燕，張?zhí)鞁?，汪　靜，馬　嶸，張江濤

(北京醫(yī)院 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，北京100730)

柱前衍生高效液相色譜測(cè)定糖化血紅蛋白

王冬環(huán)*，周偉燕，張?zhí)鞁桑綮o，馬嶸，張江濤

(北京醫(yī)院 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，北京100730)

摘要：目的建立一種柱前衍生高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)的方法。方法蛋白內(nèi)切酶 Glu-C 將血紅蛋白從β鏈N末端水解得到糖基化和非糖基化的六肽(HbA1c六肽和HbA0六肽)，HbA1c六肽和HbA0六肽與對(duì)氨基苯磺酸進(jìn)行衍生反應(yīng)，生成糖基化和非糖基化偶氮六肽衍生物，采用高效液相色譜對(duì)衍生物進(jìn)行分離、測(cè)定，根據(jù)HbA1c衍生六肽和HbA0衍生六肽的峰面積比計(jì)算樣本中HbA1c的量。結(jié)果對(duì)高、中、低不同濃度血樣進(jìn)行反復(fù)多次分析，總變異系數(shù)CV分別為1.61%、1.74%和0.90%；HbA1c濃度在0.3% -15.6%范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y=1005X+7.26，R=0.995 9，線性關(guān)系良好；對(duì)低、中、高3個(gè)濃度的HbA1c國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW09181、GBW09182和GBW09183)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定值與認(rèn)證值的偏差在-3.81%-3.53%之間。采用本研究方法和常規(guī)方法分別對(duì)20份人血樣本進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)回歸方程為Y=0.928X+0.407，相關(guān)系數(shù)為R=0.996 5，二者有良好的相關(guān)性。 結(jié)論建立了柱前衍生HPLC測(cè)定HbA1c的方法，本法具有很好的穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：血紅蛋白A，糖基化；肽；柱前衍生；色譜法，液相

(ChinJLabDiagn,2015,19:1991)

糖尿病已成為21世紀(jì)全球范圍的流行病。2014年全球糖尿病患者數(shù)為3.87億，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到5.92億[1]。而我國(guó)就有1.139億，居世界首位，此外，還有50%的中老年人是糖尿病后備軍[2]。 糖尿病是視網(wǎng)膜、腎臟、足及神經(jīng)病變的主要危險(xiǎn)因素，更是缺血性心臟病和中風(fēng)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[3]，嚴(yán)重威脅患者的生存質(zhì)量以及生命[4]。糖化血紅蛋白(HbA1c)是世界衛(wèi)生組織及國(guó)際專家委員會(huì)推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，是糖尿病血糖控制的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6],也是評(píng)估糖尿病微血管、大血管并發(fā)癥的重要指標(biāo)[7,8]。HbA1c可以反映最近2-3個(gè)月的平均血糖水平,與傳統(tǒng)的糖尿病診斷指標(biāo)相比，具有樣本穩(wěn)定、個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異小、抽血時(shí)間不受限制、不易受干擾等優(yōu)點(diǎn)，是糖尿病診斷、篩查和管理的有效指標(biāo)[9]，因此，保證糖化血紅蛋白測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性為臨床提供可靠的依據(jù)至關(guān)重要。

HbA1c的常規(guī)測(cè)定方法有多種，尤其在我國(guó)，多達(dá)幾十種，由于采用的原理與技術(shù)不同，因此測(cè)定結(jié)果的可比性和準(zhǔn)確性有待提高。HbA1c測(cè)定有國(guó)際公認(rèn)的參考方法，是國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine，IFCC)建立的高效液相串聯(lián)電噴霧電離一級(jí)質(zhì)譜(或高效液相串聯(lián)毛細(xì)管電泳，兩個(gè)方法結(jié)果一致)參考測(cè)量程序[10]，并推薦使用mmol/mol為HbA1c的單位[11]。由于IFCC推薦的HbA1c參考測(cè)量程序采用一級(jí)質(zhì)譜，使用氰基柱，在精準(zhǔn)性方面有些不足。德國(guó)學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了改良，增加流動(dòng)相中三氟乙酸的濃度并改變了洗脫梯度，解決了峰脫尾的問題并有效地改善了峰形，穩(wěn)定了保留時(shí)間，提高了分析精密度[12]，但同時(shí)增加了質(zhì)譜分析響應(yīng)信號(hào)的離子抑制風(fēng)險(xiǎn)[13,14]和質(zhì)譜的污染；還有學(xué)者采用C12柱替代氰基柱[15]，但以上兩種改進(jìn)都需要配備轉(zhuǎn)向閥和輔助泵，增加了實(shí)驗(yàn)成本。

我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了IFCC 推薦的LC-MS/MS測(cè)定HbA1c參考測(cè)量程序，現(xiàn)為IFCC網(wǎng)絡(luò)參考實(shí)驗(yàn)室，考慮到質(zhì)譜測(cè)定操作復(fù)雜，測(cè)定成本高昂，所需校準(zhǔn)品運(yùn)輸困難，根據(jù)我們檢測(cè)HbA1c的有關(guān)經(jīng)驗(yàn)，利用HbA1c是糖基化血紅蛋白與血紅蛋白的比值及組成血紅蛋白的活性氨基酸可以衍生的特點(diǎn)，探討了一種柱前衍生高效液相色譜測(cè)定HbA1c的方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6個(gè)濃度水平的HbA1c國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)Pcal2012-A-Pcal2012-F(認(rèn)證值分別為：0.0 mmol/mol，29.3 mmol/mol，58.7 mmol/mol，87.5 mmol/mol，117.4 mmol/mol，146.9 mmol/mol，IFCC，比利時(shí))；3個(gè)濃度水平的HbA1c國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09181- GBW09183(認(rèn)證值分別為：38.4 mmol/mol (5.67%)、52.7 mmol/mol (6.97 %)、88.7 mmol/mol (10.27 %)，中國(guó))。

1.1.2試劑蛋白內(nèi)切酶 Glu-C(美國(guó)NEB公司)，色譜純合成HbA1c六肽及HbA0六肽(上?？齐墓?，色譜純乙腈(美國(guó)Fisher公司)，β嗎啉乙磺酸(德國(guó)Sigma公司)，氯化鈉﹑醋酸銨﹑對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、氯化銨、磷酸二氫鈉和氫氧化鈉分別為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3儀器Ultimate 3000系統(tǒng)(美國(guó)Dionex公司)，3K15離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，282A真空干燥箱(美國(guó)Fisher公司)，恒溫振蕩器(型號(hào)Unimax1010，德國(guó)Heidolph公司)，天平(型號(hào)XPE105，瑞士Mettler公司)，HLC-723 G7 糖化血紅蛋白檢測(cè)儀及配套試劑(日本Tosoh公司)。

1.1.4血液樣本 2014年北京醫(yī)院內(nèi)分泌科住院、門診患者及志愿者的EDTA抗凝全血樣本，其中，男23例，女16例，年齡23-68歲，平均年齡48.3歲。

1.2樣品處理及測(cè)定

1.2.1衍生試劑配制A液：稱取0.09 g對(duì)氨基苯磺酸，加入濃鹽酸0.9 ml，加水至10 ml，超聲至完全溶解，再與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液混合置棕色瓶中，放入冰箱1 h后使用；衍生B液為10%的硝酸鈉溶液；氯化銨-氨水緩沖液：稱取0.8 g氯化銨，置于燒杯中，加水溶解，用12 mol/L濃氨水調(diào)pH 至9.6，置于100 ml容量瓶中，定容至刻度。

1.2.2樣品前處理方法

①溶血液的制備及酶解1.5 ml EDTA抗凝全血，于8 ℃ 3 000 g離心10 min，除去上層血漿；向下層紅細(xì)胞中加入10 ml 0.15 mol/L 氯化鈉溶液，置37 ℃溫浴4 h，離心20 min，棄去上清液，重復(fù)該步驟，清洗紅細(xì)胞2次；加入等體積超純水，混勻；離心20 min，棄去沉淀物，小心吸取上層溶液，加入10 ml含穩(wěn)定劑的水溶液(50 mmol/L β嗎啉乙磺酸、10 mmol/L 碳酸氫鈉，1 mmol/L Na2-EDTA，pH 6.2)，混勻，制成溶血液，待用。取30 μl溶血液于玻璃安瓿中，加入50 μl 200 μg/ml Glu-C內(nèi)切酶溶液，再用消化液(50 mmol/L醋酸銨，pH 4.3)將體積補(bǔ)足到500 μl，置(37±2)℃恒溫振蕩器18 h取出，-20 ℃冰箱停止消化，得到HbA1c六肽和HbA0六肽，待衍生用；6個(gè)濃度的HbA1c國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)Pcal2012-A- Pcal2012-F及3個(gè)濃度的HbA1c國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09181- GBW09183同步進(jìn)行酶解消化。

②HbA1c六肽﹑HbA0六肽衍生化在1 ml氯化銨-氨水緩沖液中，先加入0.5 ml酶解液樣品，然后分別加入1 ml衍生A液、1 ml衍生B液，搖勻，置于室溫，反應(yīng)20 min，進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3HPLC分析條件所用色譜柱為Zorbax Eclipse C18柱(4.6 mm*150 mm，粒徑5 μm，美國(guó)Agilent公司)。柱溫：25℃，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：20 μl，流動(dòng)相A液：0.015 mmol/L 磷酸二氫鈉，流動(dòng)相B液：乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　液相色譜梯度洗脫程序

1.3方法性能評(píng)價(jià)

1.3.1精密度用低、中、高3個(gè)濃度的血樣(HbA1c濃度分別為5.5%，6.8%和10.7%)考察本方法的精密度，用本法測(cè)定3批樣本，每批每個(gè)濃度測(cè)3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣重復(fù)進(jìn)針3次，將3次結(jié)果的平均值作為1個(gè)平行樣的結(jié)果，這樣，每個(gè)樣品可得到9個(gè)測(cè)定結(jié)果，以批內(nèi)CV和總CV表達(dá)本方法的精密度。

1.3.2特異性為檢驗(yàn)本方法的特異性，首先取1份混合EDTA抗凝血樣，分為3份，1份樣本不做處理，另外2份樣本分別進(jìn)行甲?；幚砗鸵阴；幚?，然后分別用本方法和常規(guī)離子交換-高效液相色譜對(duì)3份樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)，比較樣本處理前后的結(jié)果有無差異，以驗(yàn)證方法的特異性。樣本的甲?；幚恚涸?份樣本中加入2 mmol/l 氰酸鉀，置于37℃溫育1 h；樣本的乙?；幚恚涸?份樣本中加入5 mmol/l 乙酰水楊酸，置于37℃溫育1 h。

1.3.3線性范圍分析6個(gè)濃度水平的國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)Pcal2012-A-Pcal2012-F，以HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽峰面積比對(duì)相應(yīng)的HbA1c認(rèn)證值作線性回歸，得到回歸方程，以確定本方法的線性范圍。

1.3.4準(zhǔn)確性用本法對(duì)3個(gè)濃度水平的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09181- GBW09183進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3批，每批測(cè)定3個(gè)平行管，每個(gè)平行管重復(fù)進(jìn)針3次，以每個(gè)濃度的平均結(jié)果與認(rèn)證值進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。

1.3.5與常規(guī)方法比對(duì)選取覆蓋HbA1c高、中、低濃度范圍共20份EDTA抗凝人血樣本，分別用本方法、常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)方法采用Tosoh G7 糖化血紅蛋白檢測(cè)儀，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，采用儀器配套校準(zhǔn)品為儀器校準(zhǔn)。以本方法所測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法所測(cè)結(jié)果做線性回歸，進(jìn)行比對(duì)。

1.3.6測(cè)量原理及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)蛋白內(nèi)切酶Glu-C將血紅蛋白β鏈N末端第6個(gè)氨基酸殘基水解，得到糖基化和非糖基化六肽，即：HbA1c六肽﹑HbA0六肽；將HbA1c六肽與HbA0六肽衍生生成HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽，用HPLC分離、定量。HbA1c在樣品中的含量可根據(jù)HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比計(jì)算得出，計(jì)算公式如下：

C =100* Ratiosig/(1+Ratiosig)

式中：C為HbA1c濃度(單位：%)，Rsig為樣品中HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比。

采用微軟Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，相關(guān)分析采用線性回歸和線性相關(guān)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1樣品處理

本方法的樣品處理主要由2部分組成，第一部分的溶血液制備及酶解主要目的是獲得短肽，以便于分析、測(cè)定，經(jīng)過Glu-C內(nèi)切酶的水解作用，血紅蛋白在β鏈N末端第6個(gè)氨基酸殘基(Glu)處斷開，得到糖基化HbA1c六肽和非糖基化HbA0六肽，即：C4H9O4-CO-CH2-NH-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH和NH2-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH。第二部分衍生，HbA1c六肽和HbA0六肽片段N端第二位是組氨酸殘基(His)，組氨酸的咪唑基與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成橘紅色偶氮產(chǎn)物，即：HbA1c衍生六肽和HbA0衍生六肽。

2.2HPLC測(cè)定條件的選擇

為獲得更好的色譜分離信號(hào)，本方法主要對(duì)所用色譜柱、柱溫、進(jìn)樣量、流動(dòng)相的組成、流動(dòng)相的比例、流速等條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇色譜柱為Zorbax Eclipse C18柱，(4.6 mm*150 mm，粒徑5 μm，美國(guó)Agilent公司)。柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μl，流動(dòng)相為0.015 mmol/L 磷酸二氫鈉：乙腈，流速為1.0 ml/min。分析色譜圖見圖1。

圖1　HbA1c衍生六肽及HbA0衍生六肽色譜圖

2.3精密度

低、中、高3個(gè)濃度水平血樣的HbA1c濃度分別為S1：4.70%，S2：6.95%和S3：9.06%，對(duì)應(yīng)的批內(nèi)CV和總CV分別為S1：0.51%，1.61%；S2：0.75%，1.74%；S3：0.38%，0.90%，本方法精密度良好。

2.4特異性

采用本方法和常規(guī)離子交換-高效液相色譜法檢測(cè)不做任何處理樣本的結(jié)果分別為6.6%，6.8%；對(duì)應(yīng)的經(jīng)過甲?；幚順颖镜慕Y(jié)果分別為6.6%，7.1%；經(jīng)過乙?；幚順颖镜慕Y(jié)果分別為6.6%，7.3%。由此可見，血紅蛋白的甲?；鸵阴；瘜?duì)離子交換-高效液相色譜法有影響，而本方法在樣本處理前后檢測(cè)結(jié)果一致，說明本方法有很好的特異性。

2.5線性范圍

6個(gè)濃度水平的國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)Pcal2012-A-Pcal2012-F 認(rèn)證值分別為：0.0 mmol/mol，29.3 mmol/mol，58.7 mmol/mol，87.5 mmol/mol，117.4 mmol/mol，146.9 mmol/mol ，以HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比對(duì)相應(yīng)的認(rèn)證值作線性回歸，回歸方程為：y=1005x+7.26(R2=0.992)，由此可見本方法的線性范圍至少為7.26 mmol/mol-146.9 mmol/mol，也可換算為0.3%-15.6%HbA1c[16]，本方法線性范圍能夠滿足臨床應(yīng)用的需求。

2.6準(zhǔn)確度

用本法對(duì)3個(gè)濃度水平的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09181- GBW09183進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3批，每批測(cè)定3個(gè)平行管，每個(gè)平行管重復(fù)進(jìn)針3次，測(cè)定結(jié)果的均值分別為：5.58% HbA1c，7.01% HbA1c，10.46% HbA1c，與認(rèn)證值的偏差分別為：-0.09%，-0.04%，0.19%，對(duì)應(yīng)的偏倚分別為-3.81%，0.96%，3.53%。

2.7與常規(guī)方法比對(duì)

選取覆蓋高、中、低濃度范圍的20份EDTA抗凝人血樣本，分別用本方法、常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。以本方法所測(cè)結(jié)果對(duì)常規(guī)方法所測(cè)結(jié)果做線性回歸，回歸方程為y=0.928x+0.407，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，顯示二者有良好的相關(guān)性。

3討論

本研究主要基于以下2個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與研究：①利用HbA1c定義為糖基化血紅蛋白與血紅蛋白比值的特點(diǎn)，根據(jù)HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比計(jì)算得出HbA1c的量；②利用血紅蛋白的活性氨基酸可以進(jìn)行衍生化反應(yīng)的特點(diǎn)，以提高液相色譜分析的分離率與靈敏度。

多肽是一類具有重要生物功能的化合物，不僅是蛋白質(zhì)和氨基酸之間的橋梁，也是蛋白質(zhì)測(cè)序中能夠直接測(cè)定的對(duì)象，與其它氨基酸相比，組氨酸常為活性中心，組氨酸殘基的咪唑基可與對(duì)氨基苯磺酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成棕紅色的偶氮化合物，即Pauly反應(yīng)。血紅蛋白由氨基酸組成，其β鏈N末端第2個(gè)氨基酸殘基恰為組氨酸，本研究將血紅蛋白水解為六肽，并與對(duì)氨基苯磺酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，由于氨基酸的衍生實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)潔、不產(chǎn)生或易于排出干擾物、色譜分離率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[17]，可增加HPLC分析、測(cè)定HbA1c的精密度與特異性。

本研究中色譜條件是定量HbA1c的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為此對(duì)色譜條件進(jìn)行了詳細(xì)的優(yōu)化，最終確定了本方法的條件。在色譜條件優(yōu)化過程中，使用了合成HbA1c六肽與HbA0六肽，對(duì)合成六肽進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，根據(jù)合成HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的分離條件及吸收峰位置確定色譜條件。在應(yīng)用本方法時(shí)，流動(dòng)相的配制是整個(gè)實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵所在。首先，在稱量磷酸二氫鈉時(shí)，稱量誤差不能大于0.020 g；另一個(gè)關(guān)鍵問題是，精確調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，pH對(duì)本方法HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽分離的影響極大，對(duì)出峰時(shí)間也有影響。因此，需使用pH計(jì)，仔細(xì)認(rèn)真調(diào)節(jié)pH。另：流動(dòng)相最好不要保存，每次使用都現(xiàn)配現(xiàn)用。

作為一個(gè)檢測(cè)方法，精準(zhǔn)性至關(guān)重要。本研究對(duì)低、中、高3個(gè)濃度全血樣本進(jìn)行反復(fù)多次分析，最后得出總CV依次為1.61%、1.74%和0.90%，說明本方法精密度良好；對(duì)3個(gè)濃度水平的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09181- GBW09183進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與認(rèn)證值的偏差分別為：-0.09%，-0.04%，0.19%，對(duì)應(yīng)的偏倚分別為-3.81%，0.96%，3.53%，結(jié)果偏倚在允許范圍內(nèi)。本方法使用對(duì)氨基苯磺酸作為衍生試劑，精密度良好，如采用帶全自動(dòng)衍生功能的自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行在線衍生，衍生后直接進(jìn)樣分析，可消除離線衍生進(jìn)樣時(shí)間不同和手工操作產(chǎn)生的誤差，避免衍生產(chǎn)物衰減的可能性，保證進(jìn)樣時(shí)間的一致，不僅可提高精密度，還可提高準(zhǔn)確性。如為提高衍生效果，也可使用兩種衍生試劑。

本方法采用國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行線性范圍的確定，國(guó)際基準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)給出的是國(guó)際單位：mmol/L，為方便臨床應(yīng)用，根據(jù)目前國(guó)際HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定，采用回歸方程N(yùn)GSP-HbA1c=0.915(IFCC-HbA1c)+2.15%[16]進(jìn)行了換算，相應(yīng)的單位為：%。

HbA1c測(cè)定方法會(huì)受到不同干擾因素的影響，常見的主要為變異血紅蛋白和衍生血紅蛋白，為證明本方法的特異性，對(duì)此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。由于本方法測(cè)定水解后的衍生六肽片段，常見的變異血紅蛋白對(duì)本方法不形成干擾，因此進(jìn)行了衍生血紅蛋白的干擾實(shí)驗(yàn)。如長(zhǎng)期服用阿司匹林，可使血紅蛋白乙酰化；慢性腎病患者，可使血紅蛋白甲?；?，本研究對(duì)此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明本方法不受衍生血紅蛋白干擾，同時(shí)也驗(yàn)證了常規(guī)離子交換高效液相色譜法受衍生血紅蛋白干擾。

本研究還測(cè)定了20份人血樣本，以初步評(píng)價(jià)本方法與常規(guī)離子交換高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果的偏差，結(jié)果表明本方法與常規(guī)離子交換高效液相色譜法有很好的相關(guān)性，進(jìn)一步證明常規(guī)離子交換高效液相色譜法與本方法是兩種可靠的檢測(cè)方法。

本方法使用對(duì)氨基苯磺酸為衍生化試劑，通過HPLC進(jìn)行分離、測(cè)定。測(cè)定準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及特異性結(jié)果表明，本方法設(shè)計(jì)合理，毋需質(zhì)譜，可報(bào)告范圍滿足臨床需求，適用于HbA1c的定量分析。

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Determination of glycated hemoglobin by pre-column derivatization and HPLC separationWANGDong-huan,ZHOUWei-yan,ZHANGTian-jiao,etal.(NationalCenterforClinicalLaboratory,BeijingHospital,Beijing100730,China)

Abstract:ObjectiveA method for separation and quantification of glycated hemoglobin by pre-column derivatization and HPLC was developed.MethodsHaemoglobin is cleaved into peptides by the enzyme endoproteinase Glu C,the glycated and non-glycated N-terminal hexapeptides of the β chain (HbA1chexapeptides and HbA0hexapeptides)were obtained,separated and quantified of HbA1chexapeptides and HbA0hexapeptides by derivation with p-aminobenzenesulfonic acid and HPLC.The percentage of HbA1cin the sample can be calculated from the peak area ratios for the HbA1cderivative hexapeptides and HbA0derivative hexapeptides.ResultsThe investigation obtain the total coefficients of variation (CV) for sample analysls were 1.61%,1.74% and 0.90%.A standard curve regression equation Y=1005X+7.26，R=0.995 9,The linearity range was 0.3% -15.6% HbA1c.The results on certified reference materials showed bias of -3.81%-3.53%%.ConclusionA highly precise and accurate method for measuring HbA1chas been developed by pre-column derivatization and HPLC.

Key words:Hemoglobin A,glycosylated; peptide; pre-column derivatization; Chromatography,liquid

(收稿日期：2015-01-14)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R446.11

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-1991-05

*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目號(hào)：81171665，81201337，81301488)