不同時期應用益生菌對膿毒癥患者腸道菌群及短鏈脂肪酸的影響

李素彥 徐鑫 楊運強 趙茜 李建國 郝清卿

不同時期應用益生菌對膿毒癥患者腸道菌群及短鏈脂肪酸的影響

李素彥 徐鑫 楊運強 趙茜 李建國 郝清卿

目的 評價在膿毒癥患者中早期應用益生菌治療是否可更好改善腸道菌微生態(tài)環(huán)境。方法 選取就診于河北省人民醫(yī)院25例患者，確診膿毒癥后72 h接受益生菌治療，給雙歧三聯(lián)活菌膠囊420 mg(長型雙歧桿菌≥0.42×106CFU，嗜酸乳桿菌≥0.42×106CFU，糞腸球菌≥0.42×106CFU)，口服或通過胃管飼入，3次/d，為較晚應用益生菌組(L組);另外，32例診斷后即(0 h)給雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊，劑型，方法同上，為早期應用益生菌組(E組)。2組患者均留取診斷即時(0 h)、72 h、1周糞便標本，分析糞便中10種常見細菌的種類變化及細菌代謝產(chǎn)物有機酸的變化。結(jié)果 E組患者糞便中“有益菌”如雙歧三聯(lián)活菌，乳酸桿菌及總生物酸明顯高于L組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。病死率、住院時間低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 對膿毒癥患者早期添加益生菌，可改善腸道微生態(tài)功能，提高生存率。

腸道;微生態(tài);有機酸;膿毒癥;益生菌;早期

21世紀初人類微生物基因組計劃(Human Microbiome Project，HMP)的研究進展表明，人體是以人類細胞為核心與共生微生物共同構(gòu)成的超有機體。腸道菌群參與調(diào)控機體免疫系統(tǒng)發(fā)育、物質(zhì)代謝、維護腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)等多種生理過程，是腸黏膜屏障的重要組成部分［1］。在膿毒癥、創(chuàng)傷、肝硬化、腸道感染等情況發(fā)生時，腸道菌群為損傷的重要靶器官，有益菌減少，致病菌數(shù)量明顯增高。益生菌作為微生物改善腸道菌群平衡的補充劑已在臨床得到廣泛應用，取得較好的臨床效果［2-4］。關(guān)于益生菌在膿毒癥患者的應用時機，目前相關(guān)報道較少，本研究的目的為確定早期應用益生菌是否可更好改善腸道菌群及腸道微環(huán)境，及評價臨床效果。本文選擇2013年6月至2015年6月就診于河北省人民醫(yī)院急診科的膿毒癥患者為研究對象，共計57例。2013年6月至2014年6月符合條件患者25例，確診膿毒癥后72 h接受益生菌治療，給雙歧三聯(lián)活菌膠囊420 mg(長型雙歧桿菌≥0.42×106CFU，嗜酸乳桿菌≥0.42×106CFU，糞腸球菌≥0.42×106CFU)，口服或通過胃管飼入，3次/d。為較晚應用益生菌組(L組);另外，2014年7月至2015年6月符合條件患者32例，診斷膿毒癥后即(0 h)給雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊，劑型，方法同上，為早期應用益生菌組(E組)。2組患者均留取診斷即時(0 h)、72 h、1周糞便標本，分析糞便中10種常見細菌的種類變化及細菌代謝產(chǎn)物有機酸的變化。為膿毒癥患者益生菌的應用時機提供臨床資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年6月至2014年6月就診于河北省人民醫(yī)院急診科膿毒癥患者25例，男15例，女10例;年齡18～77歲，平均年齡(55±17)歲;根據(jù)美國胸科醫(yī)師學會和急救醫(yī)學會(ACCP/SCCM)(2013版)標準診斷膿毒癥，72 h后給雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊(晉城海斯制藥有限公司)，420 mg(長型雙歧桿菌≥0.42×106CFU，嗜酸乳桿菌≥0.42×106CFU，糞腸球菌≥0.42×106CFU)，3次/d，口服或胃管飼入，為較晚應用益生菌組(L組);2014年7月至2015年6月就診于同醫(yī)療機構(gòu)，同診斷標準的膿毒癥患者32例，男17例，女15例;年齡19～79歲，平均年齡(55±16)歲;患者診斷后即(0 h)給雙歧桿菌三聯(lián)活菌囊，420 mg(長型雙歧桿菌≥0.42×106CFU，嗜酸乳桿≥0.42×106CFU，糞腸球菌≥0.42×106CFU)，口服或胃管飼入，3次/d。為早期應用益生菌組(E組)。2組患者均盡早應用腸內(nèi)營養(yǎng)，在初診感染時，給廣譜抗生素，同時留取感染灶處標本行細菌培養(yǎng)，根據(jù)微生物培養(yǎng)結(jié)果，調(diào)整為針對性抗生素。2組患者均持續(xù)應用益生菌直至試驗終點。本試驗經(jīng)過河北省人民醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 入選標準 (1)年齡18～80歲;(2)入住ICU時間大于1周。

1.3 排除標準 (1)4周內(nèi)使用過抗生素及腸道微生物制劑;(2)腸道感染引起的膿毒癥;(3)4周內(nèi)有重大的或復雜的腹部手術(shù)史者;(4)妊娠及哺乳期女性;(5)重度肥胖患者(BMI＞35 kg/m2)。

1.4 糞便標本的留取及腸道細菌培養(yǎng) 根據(jù)Lozupone等［5］報道，選取人類腸道菌群最常見菌培養(yǎng)類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、韋榮球菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、假單胞菌進行分析。2組患者各時間點糞便后用無菌長棉拭子取出放置于厭氧試管中，試管為含有7%的H2和5%CO2，余氣體為N2。培養(yǎng)之前，稱重后放入冰柜中冷藏。細菌培養(yǎng):改良后VL-G瓊脂滾管(加入0.2%纖維二糖，0.2%麥芽糖)培養(yǎng)總厭氧菌并確定數(shù)量。根據(jù)菌體的形狀、大小、染色、排列、芽孢等確定菌種，選擇培養(yǎng)基，不同細菌選擇性分離置于不同培養(yǎng)基中:卡那-萬古霉素凍溶血瓊脂(KVLB):80 μg/ml萬古霉素及 100 μg/ml卡那霉素加入VL-G瓊脂滾管中，培養(yǎng)類桿菌;CW瓊脂(青島日水生物科技有限公司)培養(yǎng)磷脂酶陽性梭菌;MPN瓊脂培養(yǎng)雙歧桿菌，COBA瓊脂(北京朋利馳科技有限公司)培養(yǎng)腸球菌;加入實驗室肉汁粉的LBS瓊脂(上海遠慕生物科技有限公司)培養(yǎng)乳酸桿菌;葡萄球菌選擇性瓊脂110號(上海谷研實業(yè)有限公司)培養(yǎng)葡萄球菌;DHL瓊脂(上海谷研實業(yè)有限公司)培養(yǎng)腸桿菌;NAC瓊脂(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)培養(yǎng)假單孢菌。CW瓊脂及LBS瓊脂培養(yǎng)厭氧菌在37.0℃培養(yǎng)72 h。均值于恒溫厭氧菌培養(yǎng)箱(Binder，德國)，經(jīng)過培養(yǎng)，培養(yǎng)試管中的菌落計數(shù)并稱重，計算每克糞便(濕便)中細菌數(shù)。為方便計數(shù)，細菌菌落總數(shù)(CFU/g)換算為log10 CFU。應用此辦法，細菌可檢出最低數(shù)為1 000 CFU/g，已有多項研究采用上述技術(shù)行細菌培養(yǎng)并發(fā)表［6，7］。

1.5 有機酸濃度的檢測 培養(yǎng)液中短鏈脂肪酸含量的分析采用文獻中報道的方法［8］，使用Agilent HPLC 1260進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基本情況比較 所有接受益生菌患者均耐受治療，未發(fā)生不良反應，2組性別比、年齡、APACHEⅡ評分、感染部位、抗生素使用、腸內(nèi)營養(yǎng)種類及時機等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

2.2 2組患者各時間點糞便菌群分析 總厭氧菌數(shù)量E組在72 h及1周時均高于L組，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對人體有益的細菌，包括雙歧桿菌、乳酸桿菌，在72 h、1周分析糞便標本L組明顯低于E組。雙歧桿菌:72 h(4.8±2.5，7.9±2.0)，1周(5.6±0.19，9.4±1.00);乳酸菌:72 h(3.5±1.9，6.0±2.0)，1周(3.8±0.19，7.8±2.1)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。腸道正常存在主要菌群類桿菌，在72 h、1周分析糞便標本，L組明顯低于E組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。致病菌葡萄球菌在72 h、1周分析糞便標本L組明顯高于E組，72 h(6.0±1.5，3.2±2.0)，1周(5.0±1.8，2.7±0.8)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。E組患者雙歧桿菌、乳酸桿菌、類桿菌在72 h、1周明顯高于0 h，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。E組患者葡萄球菌在72 h、1周明顯低于0 h，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表1 2組患者基本情況比較

2.3 2組患者各時間點糞便有機酸含量分析 2組各時間點有機酸統(tǒng)計，總有機酸量E組在72 h及1周時均高于L組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對人體有益的短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸，在72 h、1周分析糞便標本，L組明顯低于 E組。乙酸:72 h(33.2±19.2，55.9±21.0)，1周(40.8±21.7，66.9±25.6);丙酸:72 h(4.9±7.6，13.6±9.8 P)，1周(10.0±6.5，18.7±9.3);丁酸:72 h(1.2±0.7，11.5±0.5)，1周(4.5±2.7，16.3±6.5)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。乙酸、丙酸、丁酸E組患者在72 h、1周明顯高于0 h，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表3。

2.4 2組患者住院時間及病死率分析 E組住院時間、病死率低于L組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4。

3 討論

正常成人的腸道菌群總重量約1～2 kg［9］，是人體細胞總數(shù)的10倍，包含的基因數(shù)量是人類基因數(shù)量的150倍。由此數(shù)量龐大的腸道菌群和宿主形成一個“超級生物體”，相互作用，實現(xiàn)生態(tài)共享，影響著人體的生理代謝，并為宿主提供不具備的酶和生化代謝通路［9］。2004年Gordon主持的系列研究首次表明:腸道菌群作為一種“內(nèi)化了的環(huán)境因子”，可以直接調(diào)控機體的脂肪合成與存儲相關(guān)基因的表達，2007年，美國國立衛(wèi)生研究院啟動了“人類微生物組計劃”(HMP)。2008年，歐盟啟動了腸道元基因組第七框架項目(MetaHIT)，開啟了腸道菌群與創(chuàng)傷、膿毒癥、糖尿病、肝性腦病等各種疾病的研究熱潮［2-4，10］。

表2 2組患者糞便菌群分析log CFU/g，±s

表2 2組患者糞便菌群分析log CFU/g，±s

注:與L組比較，*P ＜0.05;與0 h比較，#P ＜0.05

菌群72 h L組(n=25) E組(n=32)0 h L組(n=25) E組(n=32)1周L組(n=25) E組(n=32)專性厭氧菌總數(shù) 8.1±2.3 8.2 ±2.3 8.3±1.3 10.0±0.8 8.30±2.0 10.2±1.2類桿菌 8.1±2.4 8.1±2.1 6.8±3.7 9.5±1.2* 7.0±3.5 10.10±0.4*雙歧桿菌 4.6±2.1 4.5±2.0 4.8±2.5 7.9±2.0*# 5.6±0.19 9.4±1.0*#梭狀芽孢桿菌 2.2±0.7 2.1±0.6 2.3±0.8 2.1±0.7 1.9±2.0 2.0±0.7韋榮球菌 2.8±0.6 2.9±0.7 3.1±0.4 3.4±0.5 3.7±0.8 3.9±0.4兼性厭氧菌總數(shù) 8.4±1.5 8.3±0.7 8.5±0.6 8.4±0.7 8.2±1.5 8.3±1.1乳酸桿菌 3.4±2.1 3.6±1.8 3.5±1.9 6.0±2.0*# 3.8±1.9 7.8±2.1*#腸桿菌 5.9±1.8 5.8±2.0 6.1±2.4 6.2±0.5 6.1±2.5 5.9±2.2腸球菌 5.4±2.1 5.5±1.9 5.4±1.4 6.7±2.2 6.0±2.1 7.0±2.3葡萄球菌 5.4±1.2 5.3±1.1 6.0±1.5 3.2±2.0*# 5.0±1.8 2.7±0.8*#假單胞菌 2.7±0.5 2.9±0.6 3.0±0.4 2.8±0.4 3.0±0.9 3.1±1.0

表3 2組患者糞便有機酸含量分析log CFU/g，±s

表3 2組患者糞便有機酸含量分析log CFU/g，±s

注:與L比較，*P ＜0.05;與0 h比較，#P ＜0.05

有機酸72 h L組(n=25) E組(n=32)0 h L組(n=25) E組(n=32)1周L組(n=25) E組(n=32)有機酸總量 49.2±32.3 33.2 ±29.3 49.4±31.3 75.9±28.8*# 57.7±32.0 91.2±36.2*#琥珀酸 3.5±0.2 3.7±0.4 4.1±0.6 3.9±0.5 4.3±0.7 4.0±0.8乳酸 5.4±0.3 5.5±0.5 6.1±0.7 5.9±0.8 5.8±0.5 5.4±0.7甲酸 3.0±0.8 3.1±0.9 3.9±0.5 4.0±0.7 3.8±0.6 3.7±0.5乙酸 33.2±24.5 31.5±20.1 33.2±19.2 55.9±21.0*# 40.8±21.7 66.9±25.6*#丙酸 3.1±0.8 4.5±0.8 4.9±7.6 13.6±9.8*# 10.0±6.5 18.7±9.3*#異丁酸 0.6±0.8 0.8±0.4 0.7±0.5 0.6±0.7 0.9±0.5 0.7±0.6丁酸 0.9±1.2 1.0±1.3 1.2±0.7 11.5±0.5*# 4.5±2.7 16.3±6.5*#異戊酸 1.3±1.1 1.2±1.2 1.4±1.0 1.5±1.1 1.2±0.8 1.4±0.9戊酸 0.4±1.0 0.3±1.1 0.3±0.9 0.5±1.0 0.4±0.8 0.5±0.9 pH值 7.1±0.8 7.0±0.9 7.1±0.9 6.7±0.7*# 7.2±0.5 6.6±0.4*#

表4 L組與E組患者住院時間及病死率分析±s

表4 L組與E組患者住院時間及病死率分析±s

注:與L組比較，*P ＜0.05

指標 L組(n=25) E組(n=32)住院時間(d) 19±10 11±5*病死率(%) 40.3±15.1 21.6±9.4*

現(xiàn)有研究表明，膿毒癥、肝硬化、肝性腦病、哮喘、婦科卵巢切除等多種疾病可引起腸道菌群失調(diào)，同時腸道菌群失調(diào)可加重疾病的惡化。對腸道菌群進行干預對多種疾病中的治療有重要的作用［2-4，10，11］。

膿毒癥是由感染引起的全身炎性反應綜合征。隨著人口的老齡化、腫瘤發(fā)病率上升及侵入性醫(yī)療手段的增加，膿毒癥的發(fā)病率不斷上升，每年全球新增數(shù)百萬膿毒癥患者，其中超過1/4患者死亡。按照全球膿毒癥聯(lián)盟公布的數(shù)據(jù)顯示［12］，因膿毒癥死亡的人數(shù)超過了前列腺癌、乳腺癌、艾滋病死亡人數(shù)的總和。過去十年，發(fā)達國家膿毒癥發(fā)病率每年以8% ～13%的速度劇增;而在發(fā)展中國家，膿毒癥病死率也居高不下。嚴重膿毒癥和膿毒性休克是重癥醫(yī)學面臨的重要臨床問題［13］。

如何通過改善膿毒癥患者的腸道微生態(tài)環(huán)境，提高膿毒癥的生存率越來越受到ICU醫(yī)生的重視［14］，Shimizu等［6］報道應用益生菌的SIRS患者較未用益生菌患者腸道微環(huán)境更接近正常人。對益生菌的應用時機相關(guān)報道較少［15，16］。Evans-Pyles 等［17］研究證實30%皮膚被燒傷的小鼠，在燒傷5 min內(nèi)即出現(xiàn)腸道黏膜屏障功能受損，腸道菌群異常，4 d達損害高峰，21 d腸道黏膜屏障及腸道菌群仍為異常狀態(tài)。De-Souza等［18］研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者腸道功能在診斷時即出現(xiàn)異常。

現(xiàn)有膿毒癥的治療同樣強調(diào)及時性，多項研究報道膿毒癥休克如果在l h內(nèi)得到正確的診治，患者的存活率將達到80%以上;而在膿毒癥休克6 h之后診治，患者的生存率即會下降至 30%［19，20］。

因此，診斷膿毒癥早期給益生菌，可能會對腸道菌群維持，進而對腸道黏膜屏障功能、免疫等及時干預，改善膿毒癥預后。本研究中，早期添加益生菌，對人體有益的細菌，包括雙歧桿菌、乳酸桿菌，在72 h、1周分析糞便標本E組明顯高于L組。雙歧桿菌、乳酸桿菌、類桿菌E組患者在72 h、1周明顯高于0 h。致病菌葡萄球菌在72 h、1周分析糞便標本L組明顯高于E組，E組患者葡萄球菌在72 h、1周明顯低于0 h。上述結(jié)果驗證了早期應用益生菌可改善膿毒癥患者腸道菌群的構(gòu)成，有利于維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定。

穩(wěn)定的腸道微生態(tài)環(huán)境通過宿主和腸道細菌之間的持續(xù)相互作用，維持腸道免疫系統(tǒng)的平衡。Lathrop等［21］報道腸道微生物能調(diào)控宿主腸道中T細胞群的生成，而腸道微生物的失調(diào)則會導致機體免疫系統(tǒng)的異常。Kawamoto等［22］研究表明腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂會導致全身免疫系統(tǒng)過度活躍。Org等［23］研究證明:腸內(nèi)菌群不但對先天性免疫及腸道黏膜免疫有重要作用，同時可通過炎癥及血管反應影響腸道的微循環(huán)，觀察腸道無菌的小鼠，分泌IgA的細胞及CD4T細胞均顯著下降，平衡的腸道菌群被外來生物破壞后可引起免疫系統(tǒng)應答，導致炎性反應，最終破壞黏膜屏障。Sartor［24］報道益生菌與腸黏膜上皮細胞緊密結(jié)合，提高黏膜防御屏障，組織致病菌的定植和入侵，提高抗炎細胞因子水平，與病原競爭性黏附于上皮細胞，促進上皮細胞分泌黏液，使其在黏膜和微生物之間形成保護層，防止棲生菌易位等。綜上，腸道菌群可做為改善膿毒癥預后的治療靶點。本試驗表明，膿毒癥早期，在腸道生態(tài)系統(tǒng)尚未完全“崩坍”之前應用益生菌，可及時改善腸道菌群構(gòu)成。這可能是早期添加益生菌(E組)相對較晚添加益生菌(L組)的患者住院時間短，生存率高的原因。

另外，本研究中同時發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸(SCFAs)，包括乙酸、丙酸、丁酸，在72 h、1周分析糞便標本，L組明顯低于E組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，乙酸、丙酸、丁酸E組患者在72 h、1周明顯高于0 h，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。上述結(jié)果提示早期應用乳酸菌的患者，糞便中短鏈脂肪酸含量增加。Backhed等［25］證實腸道內(nèi)微生物群落的基因多樣性為宿主提供了其不具備的酶和生化代謝通路，編碼大量的糖苷水解酶，將多糖轉(zhuǎn)化為單糖和代謝終產(chǎn)物短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是指碳原子小于6個的有機脂肪酸，主要由不消化的碳水化合物在結(jié)腸內(nèi)經(jīng)厭氧菌酵解而成，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占SCFAs總量的90% ～95%。短鏈脂肪酸，尤其是丁酸，有利于維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和平衡，有利于腸上皮細胞的生長和代謝，抑制病原菌的生長以及維持腸道免疫系統(tǒng)的平衡［26，27］。Canfora 等［28］研究發(fā)現(xiàn)丁酸還可以通過阻止NF-κB激活達到抗炎作用，丁酸被認為是抗生素的潛在替代物。乙酸是腸道內(nèi)多數(shù)細菌酵解的主要代謝產(chǎn)物，是新生兒腸道中最先出現(xiàn)的SCFAs。一項體外檢測生理濃度SCFAs對新生鼠腸黏膜屏障作用的研究顯示，生理濃度的乙酸在維持正常腸黏膜屏障功能比丁酸更為有效。丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后主要由肝臟代謝，參與糖異生作用，抑制膽固醇合成［25］。綜上，早期應用益生菌，益生菌的代謝產(chǎn)物如丁酸等較晚期應用增多，可進一步促進腸道上皮細胞的生長代謝、抑制病原菌生長、維持腸道免疫平衡，抗感染等，這可能是早期添加益生菌(E組)相對較晚添加益生菌(L組)的患者住院時間短，生存率高的另一個原因。

本研究樣本量較少，研究對象為糞便中菌群，對腸道黏膜菌群未做研究，有一定的局限性;另外，隨著分子生物學的發(fā)展以及分子生物學技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域的應用，16S rDNA測序、宏基因組測定等為微生態(tài)學的研究提供了更有力的工具，國外已經(jīng)開展這方面的研究，國內(nèi)起步較晚，未來可采用上述技術(shù)對本研究進行進一步驗證。

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A

1002-7386(2015)23-3567-05

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．015

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院急診科(李素彥、徐鑫、趙茜、李建國)，心臟內(nèi)科(郝清卿);河北省博野縣醫(yī)院老年病科(楊運強)

2015-06-30)