慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品制備中效價測定及原材料選擇的研究

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

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慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品制備中效價測定及原材料選擇的研究

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

在近期慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中遇到兩個問題——雙圈與可靠性測驗不符合規(guī)定。通過調(diào)整菌懸液濃度、抗生素濃度及上層菌液加入量使雙圈現(xiàn)象得以抑制，以保證測量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。C組分測定結(jié)果顯示原料藥與標(biāo)準(zhǔn)品C組分差異較大，容易導(dǎo)致二者劑量反應(yīng)直線不平行，進(jìn)而影響可靠性測驗結(jié)果。通過更換與標(biāo)準(zhǔn)品C組分更為相近的原料藥使可靠性測驗符合規(guī)定。上述改進(jìn)措施保證了國家標(biāo)準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確性，以期為同業(yè)人員效價測定遇到類似問題提供借鑒。

慶大霉素；C組分；雙圈；三劑量法；可靠性測驗

慶大霉素(gentamicin，GM)是由小單孢菌屬(Micromonosporapurpurea)發(fā)酵產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相近的多組分氨基糖苷類抗生素，它們在結(jié)構(gòu)上是由脫氧鏈霉胺(purposamine)、紫素胺和3-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺縮合成的苷。臨床上使用的慶大霉素主要由Cl、Cla、C2、C2a四個活性成分組成，另外還有其他幾個微量組分，如西索米星(sisomicin)、慶大霉素C2b(也稱為沙加霉素，sagalnicin)、二-氫氧-慶大霉素C2a(Antibiotic JI-20 B，它是Cl、C2和C2a的前導(dǎo)物)等[1-2]。多組分抗生素對檢定菌抑菌作用存在差異，易發(fā)生雙圈現(xiàn)象，在獸藥典抗生素微生物檢定法[3]規(guī)定范圍內(nèi)，通過調(diào)整菌濃、加菌量、加藥量等措施可使雙圈得以抑制。原料藥與標(biāo)準(zhǔn)品組分差異較大時，易導(dǎo)致二者劑量反應(yīng)直線不平行，進(jìn)而影響可靠性測驗結(jié)果。通過更換與標(biāo)準(zhǔn)品組分更為相近的原料藥，可使可靠性測驗結(jié)果符合規(guī)定。近期，在慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品換批制備過程中，遇到了上述兩個問題，通過相應(yīng)改進(jìn)措施使問題得以解決。

1 材料與方法

1.1 儀器材料與試藥 抗生素效價測量儀(北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。抗生素I號培養(yǎng)基、pH值7.8的磷酸鹽緩沖液及滅菌水均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中海公司提供；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品及檢定菌CMCC(B)63202凍干管購于中國食品藥品檢定研究院。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品批號130326-201015，效價630單位/mg。1.2 雙圈現(xiàn)象的解決方法 在效價測定條件摸索階段，發(fā)現(xiàn)菌碟雙圈現(xiàn)象極為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)了三圈或四圈的情況。為盡量減小雙圈現(xiàn)象對效價測量的影響，采取了調(diào)整菌懸液濃度、抗生素濃度及上層菌液加入量等措施。將優(yōu)化前后條件總結(jié)如表1。

表1 效價測定方法優(yōu)化前后條件對比表

1.3 可靠性測驗不符合規(guī)定的解決方法 《中國獸藥典》二〇一〇年版附錄生物檢定統(tǒng)計法[3]對三劑量法效價測定可靠性測驗的如下4個參數(shù)進(jìn)行了規(guī)定：回歸需具有顯著性差異(即P<0.01)，偏離平行、二次曲線及反二次曲線均需不具有顯著性差異(即P>0.05)。然而，在對該批原料藥進(jìn)行效價賦值時，總是存在偏離平行、二次曲線或反二次曲線中的一項或兩項甚至三項不符合規(guī)定的情況。為避免人員個體誤差的干擾，更換檢驗員進(jìn)行了重復(fù)試驗；為避免方法誤差的干擾，采用濁度法代替管碟法進(jìn)行了測定。然而，無論如何改進(jìn)，上述問題仍然存在。懷疑可能是由于該批原料藥與標(biāo)準(zhǔn)品的組分差異過大，導(dǎo)致二者具有明顯異質(zhì)性，從而影響了可靠性測驗結(jié)果。因此重新購買了一批原料藥，并根據(jù)《中國獸藥典》二〇一〇年版硫酸慶大霉素[3]的方法對這2批原料藥的C組分進(jìn)行了測定與比較。然后根據(jù)藥典方法對這兩批原料藥進(jìn)行了效價測定與可靠性測驗分析。最終選擇了與標(biāo)準(zhǔn)品C組分更為相近的一批原料藥作為本次標(biāo)準(zhǔn)品制備的原料。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件改進(jìn)前后抑菌圈效果對比 提高菌懸液濃度和降低抗生素濃度都可以起到減小抑菌圈直徑的作用。而直徑減小必然導(dǎo)致各層菌圈間距縮小，甚至可能出現(xiàn)菌層生長速度加快外圈將內(nèi)圈覆蓋的現(xiàn)象，從而起到抑制雙圈的作用。減少上層菌液加入量可以使抑菌圈投射在培養(yǎng)基最上層的環(huán)形擴(kuò)散面積減小。圖1為抗生素抑菌圈球形擴(kuò)散模式圖，如圖所示，當(dāng)菌層越薄時，投射在最上層的環(huán)形面積越小，抑菌圈越接近于圓形，即雙圈現(xiàn)象越不明顯。改進(jìn)前后，測得的高劑量抑菌圈直徑均在藥典規(guī)定的范圍[3](18～22mm)內(nèi)，而改進(jìn)后雙圈現(xiàn)象明顯改善，如圖2～圖3。

圖1 抗生素抑菌圈球形擴(kuò)散模式圖

圖2 條件改進(jìn)前慶大霉素抑菌圈效果圖

圖3 條件改進(jìn)后慶大霉素抑菌圈效果圖

2.2 批原料藥C組分測定及效價測定結(jié)果比較 如表2所示，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，原料藥1的C1a相差4.8%，C1相差4.3%，C2和C2a加和相差9.0%。也就是說，原料藥1雖然符合藥典關(guān)于C組分的規(guī)定，但是與標(biāo)準(zhǔn)品均質(zhì)性差異較大。

與標(biāo)準(zhǔn)品相比，原料藥2的C1a和C1分別僅有2.5%和1.4%的差異，C2和C2a雖然差異為5.5%和4.6%，但二者加和(46.6%)與標(biāo)準(zhǔn)品(47.5%)僅差0.9%，且二者對慶大霉素效價貢獻(xiàn)幾乎相同，因此對其均質(zhì)性影響不大。

采用藥典方法對2批原料藥進(jìn)行了效價測定，結(jié)果原料藥2可靠性測驗均符合規(guī)定，見表3。

3 討論

3.1 雙圈問題的原因與解決措施 如前言所述，慶大霉素為多組分抗生素，不同組分對藥物效價的貢獻(xiàn)有差異，其對檢定菌抑菌作用的差異在菌碟上表現(xiàn)為抑菌圈大小不一致，因而極容易出現(xiàn)雙圈現(xiàn)象。在抑菌圈測量儀上，盡管可以通過調(diào)節(jié)閾值等參數(shù)使儀器盡量讀取同一種抑菌圈的直徑，但仍存在較大測量誤差，這為國家標(biāo)準(zhǔn)品含量賦值的精確性帶來了風(fēng)險。通過調(diào)整菌濃、加菌量、加藥量等措施可使雙圈得以抑制，以保證儀器測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 原料藥1、2與標(biāo)準(zhǔn)品C組分差異對比

表3 原料藥1、2效價測定及可靠性測驗結(jié)果對比

3.2 組分差異對可靠性測驗結(jié)果的影響 二〇一〇年版《中國獸藥典》[3]及《中國藥典》[5]對慶大霉素C組分的規(guī)定相同，均為：C1應(yīng)為25%～50%；C1a應(yīng)為15%～40%；C2+C2a應(yīng)為20%～50%?？梢钥闯?，藥典標(biāo)準(zhǔn)對每種組分相對含量的規(guī)定范圍是相當(dāng)寬泛的。楊利紅等[4]已研究了慶大霉素4種組分對其效價的貢獻(xiàn)，4種組分效價從1287單位/mg至740單位/mg不等。當(dāng)原料藥與標(biāo)準(zhǔn)品C組分差異較大時，由于各組分效價貢獻(xiàn)不同，就會導(dǎo)致二者均質(zhì)性差異大，在效價計算過程中，容易導(dǎo)致二者劑量反應(yīng)直線不平行，進(jìn)而導(dǎo)致誤差計算過程中出現(xiàn)偏離平行、二次曲線或反二次曲線具有顯著性差異的情況。而組分差異限值多少時會導(dǎo)致三劑量法可靠性測驗不符合規(guī)定？僅據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)可知，C2和C2a加和相差9.0%會導(dǎo)致上述問題出現(xiàn)，那么從不具有顯著性差異突變到具有顯著性差異的限值是多少呢？毫無疑問，這一限值對于日后標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中原料藥選取是具有指導(dǎo)性意義的。而該限值的獲得要基于進(jìn)一步的多批次原料藥C組分?jǐn)?shù)據(jù)與效價測定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。

3.3 如何選擇用于制備標(biāo)準(zhǔn)品的原料藥 由于供應(yīng)緊張，本批標(biāo)準(zhǔn)品制備采取了更換與市面標(biāo)準(zhǔn)品更為相近的原料藥的做法。實際上，更為合理的做法是，對慶大霉素原料藥廠家進(jìn)行調(diào)研與原料收集，將各批原料的C組分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，從中選取各組分相對含量位于中值的原料藥，以適應(yīng)市面上大部分慶大霉素原料與制劑的效價測定。

3.4 管碟法效價測定的影響因素 管碟法作為抗生素效價測定的經(jīng)典方法，操作步驟復(fù)雜，影響因素眾多[6]。試驗菌的活力與濃度、培養(yǎng)基的成分與pH值、緩沖液的成分與pH值、培養(yǎng)環(huán)境的無菌程度、培養(yǎng)時間與溫度、效價測量儀的精密度與準(zhǔn)確度等等都會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。各影響因素還可能存在相互影響，相互作用。在效價測定過程中，需對問題產(chǎn)生的原因認(rèn)真分析，并采取相應(yīng)對策，就可消除各影響因素產(chǎn)生的誤差，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

[1] 王岳, 方金瑞. 抗生素[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1988: 294-301.[2] Chissell J F, Freeman M, Loran J S,etal. British pharmacopoeial gentamicin sulfate component ratio test by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr, 1986, 369: 213-217.

[3] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2010： 附錄121-128， 附錄161-184， 294-296.

[4] 楊利紅，常艷，姚尚辰，等. HPLC法同時測定慶大霉素的組分純度和效價活性[J]. 藥學(xué)學(xué)報ActaPharmaceuticaSinica，2012, 47(12)：1660-1666.

[5] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典二〇一〇年版二部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:976-977.

[6] 李凡，朱志華，姜鳳麗，等.管碟法測定生物效價影響因素的探討及改進(jìn)[J].中國獸藥雜志，2008,42(1)：45-48.

(編輯：侯向輝)

農(nóng)業(yè)部決定在食品動物中停止使用洛美沙星等4種獸藥

(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2292號)

為保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全，我部組織開展了部分獸藥的安全性評價工作。經(jīng)評價，認(rèn)為洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑可能對養(yǎng)殖業(yè)、人體健康造成危害或者存在潛在風(fēng)險。根據(jù)《獸藥管理條例》第六十九條規(guī)定，我部決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，撤銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號。現(xiàn)將有關(guān)事項公告如下。

一、自本公告發(fā)布之日起，除用于非食品動物的產(chǎn)品外，停止受理洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號的申請。

二、自2015年12月31日起，停止生產(chǎn)用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑，涉及的相關(guān)企業(yè)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號同時撤銷。2015年12月31日前生產(chǎn)的產(chǎn)品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2016年12月31日起，停止經(jīng)營、使用用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

農(nóng)業(yè)部

2015年9月1日

摘自中國獸藥信息網(wǎng)

Titer Determination and Selection of Raw Materials for the Preparation of Gentamicin Standard

HAN Ning-ning, XU Yuan, YU Li-na, HAO Li-hua, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

During the preparation of the standard of gentamicin, two problems were encountered——double circles and the reliability test did not confirm to the requirement. The phenomenon of double circle was suppressed by adjusting the concentration of bacterial suspension, the concentration of antibiotics and the amount of the bacteria, in order to ensure the accuracy and reliability of results. The C component determination results showed that when the difference of C component between the raw material and the standard was obvious, the response lines of two dose were not parallel, and then the reliability test results were affected. The reliability test could confirm to its requirement by replacing the raw material with another batch which C component was more similar to the standard. These improvements ensured the accuracy of the assignment of the national standard, and provided reference for the peers when they meet the same problems during the potency determination.

gentamicin; C components; double circles; method of three doses; reliability test

韓寧寧，從事抗生素檢驗檢測工作。

趙暉。E-mail: 171977364@qq.com

2015-06-29

A

1002-1280 (2015) 09-0037-04

S859.796