樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖及CyclinD1、p16表達的影響

吉愛軍，　陸建偉，　李蘇平，　井昶雯

論著

樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖及CyclinD1、p16表達的影響

吉愛軍，陸建偉，李蘇平，井昶雯

作者單位： 210009江蘇南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院鎮(zhèn)痛科(吉愛軍)；江蘇省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(陸建偉)；

江蘇省腫瘤醫(yī)院科研科(李蘇平，井昶雯)

第一作者： 吉愛軍，男，醫(yī)學博士，副研究員，研究方向：腫瘤姑息及癌痛診療研究，E-mail:jajoffice@163.com

【摘要】目的探討樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖及CyclinD1、p16表達的影響，進一步研究其抗胃癌的可能機制。方法培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞，MTT法觀察不同時間(24 h,72 h)不同濃度樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響。用流式細胞法檢測樹舌多糖對細胞周期阻滯及其凋亡的影響。實時熒光定量法檢測樹舌多糖作用人胃癌SGC-7901細胞72 h后CyclinD1及p16的表達情況。結(jié)果隨著樹舌多糖濃度增高和作用時間的延長,對人胃癌SGC-7901 細胞增殖抑制率逐漸增高(P<0.05)，同一濃度不同時間的細胞增殖抑制率相比有顯著性差異(P<0.05)。人胃癌SGC-7901細胞在 G0/G1期表現(xiàn)出明顯的增加，S期細胞明顯的減少，各濃度組均明顯誘導細胞凋亡，其凋亡率隨樹舌多糖濃度增加而提高。實時熒光定量法檢測顯示，隨著樹舌多糖濃度的增加，CyclinD1表達逐漸減少，p16表達逐漸增加。樹舌多糖濃度0.5mg/ml,1.0 mg/ml時,CyclinD1及p16表達存在顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞有抑制增殖和促凋亡作用，呈時間和濃度依賴性，且G0/G1期細胞數(shù)量增多,S期細胞數(shù)量減少。RT-PCR法檢測顯示，CyclinD1呈現(xiàn)低表達，p16呈現(xiàn)高表達，由此推測，CyclinD1表達下調(diào)與p16表達上調(diào)可分別發(fā)揮細胞周期的正、負反饋調(diào)節(jié)，共同作用產(chǎn)生細胞增殖抑制及促進凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】樹舌多糖；胃癌；SGC-7901；增殖；CyclinD1；p16

樹舌(Ganoderma applanatum)又稱“老牛肝”、“扁芝”或“扁木靈芝”，是一種大型擔子菌，靈芝科植物樹舌靈芝的干燥子實體。樹舌藥用見于《中國藥用真菌圖譜》和《長白山植物藥志》，具有清熱、止痛、化積、止血、化痰、抗癌等功效。樹舌的化學成分包括多糖、甾體化合物、三萜、脂類、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)類、生物堿類、酚類等。樹舌具有廣泛的藥理活性，主要包括調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗病毒、消炎抗菌、降血糖、調(diào)節(jié)血壓、阻礙血小板凝集和強心作用[1]。據(jù)研究報道，樹舌多糖作為樹舌的重要成分，具有一定的抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用，且無毒性。國內(nèi)學者從增加宿主免疫功能到對腫瘤細胞的直接作用、對癌基因、抑癌基因的調(diào)控以及對蛋白質(zhì)組表達的影響等方面對樹舌多糖抗腫瘤作用進行了實驗研究[2-5]。本實驗通過樹舌多糖作用于體外培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901，觀察其對胃癌細胞增殖和cyclinD1及p16的影響，進一步探討其可能的抗胃癌機制。

1材料與方法

1.1樹舌多糖的制備樹舌多糖(含量30%)購于哈爾濱樂泰藥業(yè)有限公司岔林河中藥提取廠。按要求醇沉和去蛋白得到實驗用樹舌粗多糖。PBS溶解配成濃度為40 mg/ml原液，微孔濾膜濾過除菌，4℃冰箱保存，用時將完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2人胃癌SGC-7901細胞培養(yǎng)將人胃癌SGC-7901細胞置于細胞培養(yǎng)瓶中，選擇DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，在37℃，飽和濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天更換培養(yǎng)液，待細胞長滿瓶底80%時，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，再加入0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，倒掉胰酶，加入培養(yǎng)液，吹打均勻成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測人胃癌SGC-7901細胞增殖MTT(美國51gma公司)；二甲基亞礬(DMSO)購自GIBCO公司。用胰蛋白酶消化細胞一定的時間，待細胞呈圓形后立即加含血清的1640培養(yǎng)基終止；置于離心機，50×10 g/min 3min，棄去上清后重新加新培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)；將細胞懸浮稀釋至密度30%~40%。鋪于96孔板中，每孔200 μl，96孔板四周不加細胞懸浮液，加入適量培養(yǎng)基，以防邊緣效應，還應設置空白對照和細胞對照；置于37℃，0.5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；第二天進行加藥抑制。共設置了4個濃度，每個濃度6個平行孔，樹舌多糖濃度分別為0.125 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml；加藥后，置于37℃，0.5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h、72 h；最后測MTT。計算抑制率：

抑制率(IR%)=(1-處理組平均A值/對照組平均A值)×100%

1.4流式細胞術(shù)測定細胞周期及細胞凋亡先收集各實驗組貼壁細胞的上清，然后PBS洗2次，加胰酶消化(注意：棄液和PBS洗液均收集)；加培養(yǎng)基終止消化，打勻，再分別收到各自離心管中；離心，1 000 rpm，5 min棄液；用PBS洗滌細胞1次(離心2 000 rpm，5 min)，收集并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；加100μl RNase A 37℃水浴30 min；再加入400μl PI染色混勻，4℃避光30 min；上機檢測細胞周期，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.5實時熒光定量法檢測CyclinD1mRNA及P16mRNA表達樣本共分細胞對照組、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml組等4組?？俁NA的提取方法按試劑盒(上海捷瑞生物科技有限公司)說明進行，并取RNA樣品用滅菌水稀釋樣品100倍或適當?shù)谋稊?shù)，測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量，按以下計算RNA的濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μl，OD260/280 在1.8~2.1視為抽提的RNA的純度很高。取2 μg總用RNA逆轉(zhuǎn)錄，擴增條件：65℃水浴5 min后立即置于冰上，加入試劑的混合液，震蕩混勻后離心，37℃水浴60 min，95℃水浴5 min,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肁BI SYBR Green熒光定量試劑盒對mRNA表達水平進行檢測。PCR引物序列如下：

cyclin D1( F primer5′GCCCTCGGTGTCCTACTTCAAAT3′，R primer 5′ CTCCTCCTCGCACTTCTGTTCCT3′)；p16 (F primer 5′TGAGAAACCTCGGGAAACTTAGAT3′，R primer 5′CGGTAGTGGGGGAAGGCATATA3′); GAPDH (F primer 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′,R primer 5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′)。總反應體系:2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μl， 10 μmol /L 上、下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，去離子水補足至20 μl。循環(huán)參數(shù):50 ℃ 2 min; 95 ℃預變性2 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)。

1.6統(tǒng)計方法通過SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用χ2檢驗，計數(shù)資料采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響隨著樹舌多糖濃度(0,0.125 mg/ml,0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml)增加和作用時間(48 h,72 h)的延長,人胃癌SGC-7901 細胞抑制率逐漸增高，作用48 h后，細胞抑制率分別為0.87%、3.78%、21.75%、70.84%，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；作用72 h后，細胞抑制率分別為10.41%、21.71%、47.59%、87.92%，與對照組比差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同一濃度不同時間的細胞抑制率相比，差異均有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。樹舌多糖對人胃癌SGC-7901 細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)時間、劑量依賴關(guān)系。

表1　不同濃度樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用

注：組間比較，*：P<0.05；**：P<0.01。組內(nèi)比較,Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。

2.2樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響用流式細胞術(shù)檢測細胞周期與凋亡情況,用不同濃度的樹舌多糖(0,0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml)處理人胃癌SGC-7901細胞72 h后，0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml樹舌多糖水提濃度組細胞在 G0/G1期表現(xiàn)出明顯的增加(P<0.05)，由53.36% 升至 60.56%,S期細胞表現(xiàn)出明顯的減少，其分布由29.22%減至15.44%，提示樹舌多糖可將人胃癌SGC-7901細胞阻滯在G0/G1期(表2)。細胞凋亡分析結(jié)果：各濃度組均明顯誘導細胞凋亡(P<0.05)，其凋亡率分別為：3.53%，10.87%，15.85%，29.78%，見圖1。

表2　不同濃度樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞周期的影響(72 h)

注：與對照組比較，各組P值均<0.05。

圖2　不同濃度樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響(72 h)

2.3Real-time PCR法檢測人胃癌SGC-7901細胞cyclinD1及p16的表達情況檢測經(jīng)不同濃度樹舌多糖(0，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml)處理后的人胃癌SGC-7901細胞 (72 h) cyclinD1mRNA及p16mRNA的表達情況。隨著樹舌多糖濃度的增加，cyclinD1mRNA表達逐漸減少，p16mRNA表達逐漸增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，樹舌多糖濃度0.5 mg/ml，1.0 mg/ml時，cyclinD1mRNA及p16mRNA表達與Actin mRNA比值(2-ΔΔct)與對照組相比均存在顯著性差異(P<0.05)，見表3。

表2　不同濃度樹舌多糖處理后(72 h)的人胃癌SGC-7901細胞

注：*及**分別代表與對照組相比P<0.05、P<0.01；Δ及ΔΔ分別代表各濃度組組內(nèi)與低濃度組相比P<0.05、P<0.01。

3討論

腫瘤是一類漸進性細胞周期調(diào)控機制被破壞的疾病[6]。細胞周期中存在G1/S和G2/M期兩個重要調(diào)控點[7]。細胞周期調(diào)控作用主要是通過細胞周期蛋白(Cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin dependentkinase，CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)相互調(diào)控實現(xiàn)的[8]。

本實驗通過分析不同濃度的樹舌多糖作用于人胃癌SGC-7901細胞，結(jié)果顯示，樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞的增殖有明顯的抑制作用，而且其抑制作用有時間、劑量依賴性，即樹舌多糖的抑制作用隨著時間的延長，藥物劑量的增加而增強。同時，樹舌多糖可誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡，流式細胞儀測定有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，樹舌多糖以時間、劑量依賴方式影響人胃癌SGC-7901細胞的凋亡，樹舌多糖可使人胃癌SGC-7901細胞G0/G1期數(shù)量增多，推測樹舌多糖可能主要通過作用于人胃癌SGC-7901細胞的G0/G1期，可使部分細胞停滯于該期，從而抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖。RT-PCR法檢測結(jié)果顯示樹舌多糖濃度為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml時，CyclinD1mRNA及p16mRNA表達與Actin mRNA比值與對照組相比差異均存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且具有濃度依賴性，CyclinD1呈現(xiàn)低表達, p16呈現(xiàn)高表達，之間呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。Cyclin D是細胞周期調(diào)控中的重要蛋白，主要用于G1/S期控制點，為目前公認的癌基因。Motokura等[9]發(fā)現(xiàn)，Cyclin D在正常細胞調(diào)控和癌變過程中均發(fā)揮重要作用，其過表達可激活CDK4或CDK6活性，縮短G1期，一定程度上降低細胞增殖對有絲分裂原的依賴，造成細胞周期調(diào)節(jié)失控和細胞異常增殖。p16是G1/S期檢驗點一個重要的相關(guān)基因，其編碼的p16蛋白為Cyclin D-CDK4激酶的抑制因子，是一個重要的細胞周期調(diào)節(jié)物。p16是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)，在G1/S期發(fā)揮重要的負向調(diào)控作用，p16與CyclinD1競爭結(jié)合CDK4并抑制其活性，從而抵制對RB蛋白的磷酸化，阻止細胞進入S期，使細胞周期停滯。p16表達上調(diào)可啟動細胞周期的負反饋系統(tǒng), P16蛋白與CDK4特異性結(jié)合從而使CDK4失活,反向調(diào)節(jié)細胞周期活動, 從而阻止細胞無限制從G1期進入S期，抑制細胞增殖失控，起到抗腫瘤作用。樹舌多糖對人胃癌SGC-7901細胞的細胞周期的影響，通過本實驗研究可推測，是通過影響CyclinD1及p16等重要基因表達，從而發(fā)揮其對細胞周期的正負反饋調(diào)控作用，抑制胃癌細胞增殖，促進其凋亡，發(fā)揮其抗胃癌作用。

參考文獻：

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Effect of ganoderma applanatum polysaccharides on human gastric carcinoma Cell SGC-7901,anti-proliferation and exprssion of CyclinD1,p16JIAijun1,LUJianwei2,LISuping3,JINChangwen3(1.DepartmentofAnalgesia,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;2.DepartmentofOncology,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;3.DepartmentofScientificResearch,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China)

Correspondingauthor:JIAijun,E-mail:jajoffice@163.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Ganoderma applanatum polysaccharides(GAPS) on proliferation and apoptosis of the human gastric carcinoma cell line 7901 and its possible mechanism of action on CyclinD1,p16. MethodsThe growth inhibition effect of GAPS on human gastric carcinoma cell line 7901 was observed by using MTT assay, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of cyclinD1mRNA and p16mRNA in SGC-7901 cells were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsThe SGC-7901 cells were treated with various concentrations of GAPS for 48 h and 72 h, cell viability was determined by Alamar Blue assay. Cell growth was suppressed by GAPS of different Concentrations(0,0.125 mg/ml,0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml,1.0 mg/ml), GAPS inhibited the growth of gastric cancer cells in a dose-dependent manner. The cells were treated with various concentrations (0,0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml,1.0 mg/ml) of GAPS for 72 h. The results showed that GAPS were capable of inducing an increase in the percentages of G1-phase cells and the number of apoptotic cells (P<0.05). Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of CyclinD1 and p16 at 72 h after GAPS treatment. The results revealed a significant down-regulation of mRNA expression of CyclinD1, and up-regulation of the mRNA expression levels of p16 as compared with the controls.ConclusionsThe results show that GAPS has significant action of anti-proliferation and pro-apoptosis on human gastric carcinoma cell line 7901.The down-regulation of CyclinD1 suppresses the cell proliferation inhibition and promotes the cell apoptosis. p16 showed high expression, which can activate the negative feedback of cell cycle. The results suggest that GAPS may have an effect on the pathway of gastric cancer genesis,it prevents the cells from G1/G0 phase to S phase.

Keywords：Ganoderma applanatum polysaccharides；Gastric cancer；SGC-7901；Proliferation；CyclinD1；p16

[收稿日期：2015-06-23][本文編輯：李筱蕾]

文章編號：1674-4136(2015)06-0356-04

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.06.004

通訊作者:吉愛軍,E-mail:jajoffice@163.com

基金項目：江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(項目編號：LZ13231)