菜籽多肽穩(wěn)定性及RP-HPLC 分離制備高抗氧化活性(ORAC)組分研究

王玉梅，張 晶，謝慧慧，陳靜宜，王立峰

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

為研究加工過程中的一些環(huán)境因素是否對(duì)菜籽抗氧化肽的特性造成影響，本研究以自制的菜籽抗氧化肽為研究對(duì)象，在不同溫度、酸堿度、消化方式以及保護(hù)劑的條件下，通過菜籽抗氧化肽的肽含量變化以及抗氧化能力指數(shù)(oxygen radical absortion capacity，ORAC)的變化來驗(yàn)證其穩(wěn)定性，提出抗氧化肽的環(huán)境穩(wěn)定性條件，并進(jìn)一步對(duì)此抗氧化肽通過制備液相分離純化出抗氧化性更強(qiáng)的小分子抗氧化肽。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

菜籽多肽原料:實(shí)驗(yàn)室自制。Lowry 蛋白濃度測(cè)定試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;熒光物質(zhì)(Fluorescein sodium salt，F(xiàn)L)、自由基產(chǎn)生劑AAPH (2，2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride)、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox (6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，購自于Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);PHS-3C 雷磁pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);FreeZone 2.5L 臺(tái)式冷凍干燥機(jī)(美國LABCONCO 公司);U-3900 紫外可見分光光度計(jì)(日本HITACHI 公司);SpectraMax M2e 酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 指數(shù)測(cè)定 肽含量的測(cè)定按照蛋白濃度的方法［1，2］;抗氧化指數(shù)(ORAC)的測(cè)定［3，4］。

1.3.2 溫度對(duì)菜籽多肽穩(wěn)定性的影響 取制備好的菜籽多肽用蒸餾水配成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，取5 mL于試管中，分別放置于20、40、60、80、100 ℃的水浴中，每隔一定時(shí)間取樣，冷卻后測(cè)定其肽含量和ORAC 值。

1.3.3 pH 對(duì)菜籽多肽熱穩(wěn)定性的影響 將菜籽多肽配成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，用0.5 mol/L 的HCI 和NaOH 調(diào)pH 分別為2、4、6、8、10、12，于25、60、70℃水浴中恒溫放置30 min 后取出測(cè)定肽含量和ORAC 值。

1.3.4 人工模擬消化系統(tǒng)對(duì)菜籽多肽的穩(wěn)定性研究

(1)人工胃液中的試驗(yàn)

將pH 7.6、0.05 mol/L 的磷酸緩沖液用HCI 調(diào)pH至2，按照胃蛋白酶與肽的質(zhì)量比為1∶10、1∶20、1∶40加入多肽和胃蛋白酶，確保溶液中多肽濃度為0.5 mg/mL，37 ℃水浴消化1h 和2h 后取樣，取樣后用10%Na2CO3溶液調(diào)pH 為7.0，測(cè)定其肽含量和ORAC 值［5］。

(2)人工腸液中的試驗(yàn)

在pH7.6、0.05 mol/L 的磷酸緩沖液中按照胃蛋白酶與肽的質(zhì)量比為1∶10、1∶20、1∶40 加入多肽和胃蛋白酶，確保溶液中多肽濃度為0.5 mg/mL，置于37 ℃水浴中消化，分別在2、4、8 h 時(shí)取樣測(cè)定其肽含量和ORAC 值。

1.3.5 保護(hù)劑對(duì)菜籽多肽的熱穩(wěn)定性研究 選取丙三醇、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖五種保護(hù)劑，分別加0.5 g 上述保護(hù)劑到濃度為0.5 mg/mL 菜籽多肽溶液中，渦旋混勻后，60 ℃水浴中30 min 后取樣，冷卻后測(cè)定肽含量和ORAC 值［6］。

1.3.6 RP-HPLC 分離菜籽多肽及純度分析 取菜籽多肽配制成30 mg/mL 的溶液，0.22 μm 濾膜過濾后使用RP-HPLC 系統(tǒng)進(jìn)行分離。自動(dòng)收集各個(gè)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，并測(cè)定各個(gè)組分的抗氧化性并將抗氧化性最高組分進(jìn)行液相分析［7，8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菜籽多肽穩(wěn)定性的影響

圖1 熱處理對(duì)菜籽肽液的肽含量的影響

圖2 熱處理對(duì)菜籽肽液抗氧化性的影響

從圖1、圖2 中可以看出，隨著加熱溫度的升高和時(shí)間的延長，肽含量和ORAC 值均減小。在20、40、60 ℃水浴中加熱2 h 過程中總體肽含量都在80%以上，ORAC 值均在1 000 μmol/L TE/ (g 樣品)左右;隨著溫度逐漸升高，肽含量與ORAC 值迅速降低;80℃加熱20 min 后，肽含量和ORAC 值分別降到60%與503.68 μmol/L TE/ (g 樣品);100 ℃時(shí)，加熱20 min 后肽含量降為55%左右，ORAC 值為193.47 μmol/L TE/ (g 樣品)?？傮w說來，溫度80、100 ℃加熱處理2h 后大部分的菜籽抗氧化肽失活，溫度小于60 ℃時(shí)菜籽多肽較穩(wěn)定。

2.2 pH 對(duì)菜籽多肽熱穩(wěn)定性的影響

當(dāng)菜籽肽液的pH 值在2.0～12.0 范圍內(nèi)變化時(shí)，肽液分別于25、60、70 ℃處理30 min 的變化，圖3、4顯示pH 值對(duì)菜籽肽的熱穩(wěn)定性具有明顯影響。當(dāng)pH 6.0～8.0 時(shí)，肽液的熱穩(wěn)定性較好。pH 為8.0 時(shí)，經(jīng)25、60、70 ℃處理30 min 后的肽含量分別為70.13%、79.77%、64.47%，ORAC 值分別為 1 434.37、1 425.29、1 074.9 μmol/L TE/ (g 樣品);當(dāng)pH 為6.0時(shí)，經(jīng)此3 個(gè)溫度處理30 min 后的肽含量為77.61%、71.62%、68.30%，ORAC 值為1 511.6、1 293.82、1 180.89 μM TE/ (g 樣品)。pH 過大或過小均對(duì)菜籽多肽的穩(wěn)定性有較大影響，因此需避免過酸或過堿的情況，pH 值應(yīng)控制在6.0～8.0 之間。

圖3 不同pH 值對(duì)菜籽肽液肽含量的影響

圖4 不同pH 值對(duì)菜籽肽液的抗氧化性的影響

2.3 菜籽抗氧化肽在人工胃液中的消化試驗(yàn)

由表1 可知，在人工模擬的胃液試驗(yàn)中，隨著消化時(shí)間增加，肽含量和ORAC 值在逐漸減小;另一方面，隨著胃蛋白酶濃度增加，這2 個(gè)指標(biāo)值也在減小。pH 2.0 時(shí)，胃蛋白酶與菜籽多肽質(zhì)量比為1∶10 的條件下消化2 h 后，多肽含量降為39.02，ORAC 值降為605.95 μmol/L TE/ (g 樣品)。

表1 胃蛋白酶消化過程中菜籽抗氧化肽的穩(wěn)定性研究

2.4 菜籽抗氧化肽在人工腸液中的消化試驗(yàn)

由表2 可知，人工模擬腸液消化試驗(yàn)過程中，隨著處理時(shí)間的延長以及胰蛋白酶濃度增加，菜籽抗氧化肽液的肽含量和ORAC 值逐漸減小。pH 值為7.6，胰蛋白酶與菜籽多肽質(zhì)量比為1∶10 時(shí)消化8 h 后的肽含量和ORAC 分別降值降為37.59%和242.75 μmol/L TE/ (g樣品)。

表2 胰蛋白酶消化過程中菜籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

2.5 保護(hù)劑及濃度的選擇

選取了5 種保護(hù)劑來提高菜籽多肽在熱處理過程中的穩(wěn)定性，60 ℃水浴中加熱30 min 后肽含量和ORAC值的變化如表3 所示。

表3 保護(hù)劑對(duì)菜籽抗氧化肽熱穩(wěn)定性的影響

沒有添加保護(hù)劑時(shí)，菜籽多肽在60 ℃中加熱30 min 后，肽含量為87.76%，其ORAC 值為1 101.67 μmol/L TE/ (g 樣品)。加入不同保護(hù)劑后，加熱過程中肽含量和ORAC 值都有提高。其中丙三醇的保護(hù)效果最好，加熱后肽含量為93.58%，ORAC 值為1 412.27 μmol/L TE/ (g 樣品)。其次是蔗糖與D-果糖，加入蔗糖后溶液加熱后的肽含量為90.59%，ORAC 值為1 378.22 μmol/L TE/ (g 樣品)，加入D-果糖后溶液加熱后的肽含量為89.09%，ORAC 值為1 346.23 μmol/L TE/ (g 樣品)。葡萄糖與α-乳糖的加入并沒有起到明顯的作用。

2.6 利用RP-HPLC 進(jìn)一步分離純化菜籽肽

本研究利用RP-HPLC 進(jìn)一步對(duì)菜籽抗氧化肽進(jìn)行分離純化，收集到6 個(gè)主要組分(圖5)，分別測(cè)定這6個(gè)組分的ORAC 值，組分5 的ORAC 值最高為1 744.29 μmol/L TE/ (g 樣品)。使用分析型RP-HPLC 對(duì)組分5進(jìn)行分析，主要有1 個(gè)峰(圖6)。

圖5 半制備RP-HPLC 分離菜籽抗氧化肽

圖6 分析型RP-HPLC 分離菜籽肽組分5 的洗脫曲線

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同溫度、酸堿度、消化方式以及保護(hù)劑對(duì)菜籽多肽穩(wěn)定性的影響。溫度小于60 ℃時(shí)菜籽多肽較穩(wěn)定，溫度為80、100 ℃加熱處理2 h 后大部分的菜籽多肽失活。pH 值對(duì)菜籽多肽的熱穩(wěn)定性具有明顯影響，pH 值為6.0～8.0 時(shí)較穩(wěn)定，在過酸或過堿的條件下都不穩(wěn)定。在人工消化實(shí)驗(yàn)中，隨著酶濃度和反應(yīng)時(shí)間的增加菜籽多肽的穩(wěn)定性降低，且人工胃液對(duì)菜籽多肽穩(wěn)定性的影響比腸液的影響大。丙三醇、蔗糖和D-果糖均對(duì)多肽的穩(wěn)定性有保護(hù)作用。通過半制備RP-HPLC 的分離純化，可以收集得到具有更強(qiáng)氧化性的菜籽肽(組分5)，其ORAC 值為1 744.29 μmol/L TE/(g 樣品)。

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