野生滇橄欖多酚提取工藝的優(yōu)化

李永強(qiáng)，楊士花，岳曉川，景宏濤，李 淳，初雅潔

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201;2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語學(xué)院，昆明 650201)

滇橄欖(Phyllanthus emblica)是一種生長在中國亞熱帶和熱帶部分地區(qū)的常綠喬木。我國滇橄欖資源十分豐富，主產(chǎn)區(qū)分布在南方諸省(區(qū))，如云南、四川、貴州、廣西、廣東、福建、海南、臺(tái)灣，其中尤以云南、福建兩省的產(chǎn)量居多［1］。作為一種重要的藥食同源植物資源，滇橄欖除含有大量的氨基酸和微量元素外，在維生素C、黃酮和多酚類物質(zhì)的含量方面也相當(dāng)豐富［2］。植物多酚主要包括簡(jiǎn)單酚、酚酸類、黃酮類、木脂素類、香豆素類、鞣質(zhì)類以及芪類等化合物［3-5］，在抗衰老、抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、預(yù)防心腦血管疾病等方面效果明顯［6-10］，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。多酚類物質(zhì)是滇橄欖中最重要的功效成分，但是目前關(guān)于滇橄欖多酚提取方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以野生滇橄欖為原料，以多酚提取率為指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗(yàn)和二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)野生滇橄欖中多酚的最佳提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，為提高滇野生橄欖的綜合利用率以及滇橄欖多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

滇橄欖(采自云南省盈江縣);沒食子酸對(duì)照品，中國生物制品藥品檢定所;福林酚試劑，Sigma 公司進(jìn)口分裝;甲醇、乙醇、碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1600 型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)、BS-210S 電子天平(北京賽多科斯天平有限公司)、恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滇橄欖原料的制備 選取無霉?fàn)€的滇橄欖并清洗去核，利用組織粉碎機(jī)粉碎30s，置于冰箱中保藏。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［11，12］以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)，以不加沒食子酸的樣品為空白，用紫外分光光度計(jì)于765nm 處測(cè)定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 多酚提取得率的測(cè)定 準(zhǔn)確量取1mL 多酚提取液加入25mL 比色管中，進(jìn)行如下操作:加入5mL 0.2 mol/L 福林酚試劑，搖勻，5min 后加入7.5% Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至25mL，室溫下暗處放置1h，于765nm 下測(cè)定其吸光度(用多酚空白溶液進(jìn)行調(diào)零)。根據(jù)所測(cè)吸光值，根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得提取液中多酚含量，計(jì)算提取得率如(1)式。

(1)式中:C —提取液中多酚含量(mg/mL)、V —定容體積(mL)、Vt—提取液體積(mL)

1.3.4 滇橄欖多酚的提取 本試驗(yàn)采用乙醇作為提取溶劑［13］，考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響。

1.3.5 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用DPS 軟件，進(jìn)行三因素五水平二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)滇橄欖多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值A(chǔ) 對(duì)沒食子酸含量C 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。蘆丁濃度在0—0.3mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)滇橄欖多酚提取率的影響

精確稱取1g 滇橄欖，分別加入50%乙醇20 mL，分別在 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取2h，提取次數(shù)為2 次，過濾后定容至50mL容量瓶中，于765nm 比色測(cè)定。

由圖2 可知，隨著提取溫度的升高，多酚的提取得率呈上升趨勢(shì)，但是當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，多酚的提取得率隨著溫度的升高而下降，這是因?yàn)樘岣邷囟龋肿訜徇\(yùn)動(dòng)加快，有利于多酚的浸出，但是由于多酚中含有大量的酚羥基，性質(zhì)非?；顫?，溫度過高時(shí)不穩(wěn)定，往往發(fā)生一些不可逆的化學(xué)反應(yīng);另一個(gè)原因可能是隨著溫度的升高乙醇的揮發(fā)加劇，而使乙醇的濃度下降，降低了提取得率。所以提取溫度以40℃左右為宜。

圖2 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)滇橄欖多酚提取率的影響

精確稱取1g 滇橄欖，加入50% 乙醇20 mL，于40℃下分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3h，提取次數(shù)為2 次，過濾后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色測(cè)定。由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的延長，多酚提取得率呈上升趨勢(shì)，但是當(dāng)提取時(shí)間大于1h 后，提取得率隨著時(shí)間的延長而下降，原因可能是多酚長時(shí)間在高溫下很容易發(fā)生降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)，從而使測(cè)定值下降，所以提取時(shí)間以1h 為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.2.3 液料比對(duì)滇橄欖多酚提取率的影響

精確稱取1g 滇橄欖，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 液料比以50%乙醇于40℃下提取2h，提取次數(shù)2次，過濾后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色測(cè)定。由圖4 可知，當(dāng)液料比低于15∶1 時(shí)，提高料液比有助于提高多酚得率;當(dāng)液料比高于15∶1 時(shí)，提高料液比，多酚得率反而出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。這可能是由于液料比在15∶1 時(shí)溶劑已經(jīng)能將滇橄欖中的多酚溶解出來，液料比選用15∶1 比較合適。

圖4 液料比值對(duì)多酚提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)滇橄欖多酚提取率的影響

精確稱取1g 滇橄欖，加入50%乙醇15mL，40℃下提取2h，分別提取1 次、2 次、3 次、4 次，過濾后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色測(cè)定。由圖5 可知，隨著提取次數(shù)的增加，多酚提取得率逐漸升高;當(dāng)提取3 次以后，多酚提取得率基本保持不變，同時(shí)考慮成本與時(shí)間效益，提取次數(shù)選擇3 次為宜。

圖5 提取次數(shù)對(duì)多酚提取率的影響

2.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、液料比和提取時(shí)間進(jìn)行三因素五水平2 次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，優(yōu)化滇橄欖多酚提取工藝。

表1 因素水平編碼

2.4 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)［14］

利用DPS 軟件對(duì)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為:

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表3 可知，回歸方程失擬檢驗(yàn)F1=2.132＜F0.05(5，5)=5.05，差異不顯著，說明未控制因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很小，可進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行擬合檢驗(yàn);擬合檢驗(yàn)F2=34.637 ＞F0.01(9，10)=4.94，達(dá)到極顯著水平，說明方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映多酚提取率與提取溫度、提取時(shí)間、液料比之間的關(guān)系。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5 數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用分析［15，16］

2.5.1 主因子效應(yīng)分析 從建立的回歸方程偏回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可判斷因子的重要程度，系數(shù)的正負(fù)表示因子效應(yīng)作用的方向［14-16］。因此，各因素在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)多酚提取率作用大小依次為X3(提取時(shí)間)＞X2(液料比) ＞X1(提取溫度)，且全為正效應(yīng)。

2.5.2 單因子效應(yīng)分析 將3 個(gè)因素中的2 個(gè)固定在零水平，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行降維分析，得到以其中1 個(gè)因素為決定變量的偏回歸模型:

(1)、(2)、(3)式等3 個(gè)方程，其二次項(xiàng)系數(shù)都是負(fù)值，說明其表征的效應(yīng)曲線均是一條開口向下的拋物線，即隨著提取溫度、液料比和提取時(shí)間的不斷增加，多酚提取率將表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，說明這3 個(gè)因素均存在最佳值，太高或太低都影響多酚提取率。

2.6 試驗(yàn)因子間交互效應(yīng)分析

對(duì)數(shù)學(xué)模型的方差檢驗(yàn)表明，交互項(xiàng)偏回歸系數(shù)X1X3和X2X3達(dá)到了顯著水平，即提取溫度和提取時(shí)間、液料比和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)多酚提取率影響較大。

2.7 數(shù)學(xué)模型尋優(yōu)［14］

2.7.1 變量輪換直接尋優(yōu) 根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在－1.682 ≤Xi≤1.682 (i=1，2，3)范圍內(nèi)，每個(gè)因素取5 個(gè)水平(±1.682，±1，0)，對(duì)53=125 個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可得多酚提取率最高值為13.33%，此時(shí)各因素取值為:X1=1.682、X2=1.682、X3=－ 1.682，對(duì)應(yīng)著提取溫度為74℃、液料比為23.4∶1、提取時(shí)間為9.5min。

2.7.2 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu) 變量輪換直接尋優(yōu)法可求出優(yōu)化配方組合，但沒有考慮到隨機(jī)因素，在實(shí)際生產(chǎn)中是困難的。為此，采用計(jì)算機(jī)對(duì)不同設(shè)計(jì)水平下的組合進(jìn)行模擬試驗(yàn)，以零水平的均值11.23 為臨界值，獲得大于臨界值的方案72 個(gè)。由表4 可以看出，在95%的置信區(qū)間多酚提取率大于11.23%的優(yōu)化方案為:提取溫度為41.9—52.82℃、液料比為5.88∶1—18.55∶1、提取時(shí)間為67.36—77.62min。為了貼近實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為:提取溫度為45℃、液料比為15∶1、提取時(shí)間為70min。對(duì)此方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證得到多酚提取率為11.19%，與優(yōu)化方案的理論值11.23%比較接近，進(jìn)一步證實(shí)了方案的可靠性。

表4 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布

3 結(jié)論

(1)采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，建立影響滇橄欖多酚提取率 (Y)的提取溫度 (X1)、液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)的條件優(yōu)化數(shù)學(xué)模型為(4)式

(2)在試驗(yàn)所選的水平范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)多酚提取率作用大小依次為:X3(提取時(shí)間) ＞X2(液料比)＞X1(提取溫度)，且全為正效應(yīng)。

(3)變量輪換直接尋優(yōu)法求得各因素的優(yōu)化組合為:提取溫度74℃、液料比為23.4 ∶1、提取時(shí)間為9.5min。

(4)頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)求得在95%的置信區(qū)間多酚提取率大于11.23% 的優(yōu)化方案為:提取溫度41.9—52.82℃、液料比15.88∶1—18.55∶1、提取時(shí)間為67.36—77.62min。為了貼近工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)際，可將優(yōu)化方案定為:提取溫度為45℃、液料比為15∶1、提取時(shí)間為70min。

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