便攜式電流型葡萄糖傳感器快速檢測(cè)致奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的研究

郭 燕，竇文超，趙廣英

(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院/浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

奶牛乳腺炎是奶牛場(chǎng)最常見、經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一，其中作為發(fā)病率較高的隱性乳腺炎，無(wú)明顯的臨床癥狀，但如不及時(shí)確診和治療，可影響奶的質(zhì)量和安全。在致奶牛乳腺炎的病原微生物中，金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)是引起奶牛乳腺炎最為主要的病原菌[1]，因此建立S.aureus性乳腺炎的快速診斷方法十分必要。

利用便攜式電流型葡萄糖傳感器(Personal Amperometric Glucose Meter，簡(jiǎn)稱血糖儀)檢測(cè)血糖，具有儀器價(jià)格低，操作簡(jiǎn)單，便攜等優(yōu)點(diǎn)[2]，現(xiàn)已成為一項(xiàng)成熟技術(shù)并被廣泛地應(yīng)用于糖尿病患者的血糖監(jiān)控[3]。由于該技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，已引起其他領(lǐng)域研究者的關(guān)注。例如，通過利用蔗糖酶標(biāo)記功能DNA 檢測(cè)非葡萄糖(Glucose，Glc)的目標(biāo)物，包括DNA、生物標(biāo)記物、小分子毒素和金屬離子[4-7]，這些方法雖然有效地?cái)U(kuò)大了血糖儀的檢測(cè)范圍，但使用的DNA、抗體以及酶標(biāo)記物等生物制劑的制備較繁瑣，活性等易受貯存時(shí)間和貯存環(huán)境等條件作用而降低，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，探求借鑒于血糖儀的更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的檢測(cè)體系很有意義。本研究將血糖儀應(yīng)用于S.aureus 的定性和定量初步快速檢測(cè)，避免了使用DNA、抗體、酶等生物制劑，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、靈敏和經(jīng)濟(jì)的S.aureus 定性和定量初步快速檢測(cè)技術(shù)，為奶牛乳腺炎的臨床診斷提供了新的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 S.aureus(ZJGSMC1S0605)、大腸埃希氏菌(E.coli,ATCC 8739)、枯草芽孢桿菌(B.Subtilis，ATCC 6633)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus,ATCC 10987)、阪崎腸桿菌(E.sakazakii，ATCC 29544)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus，ZIGSFSL 1P0901)、沙門氏菌(Salmonella，CMCC 50770)、費(fèi)式檸檬酸桿菌(C.freundii，ATCC 43864)、腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens，ATCC 8071)均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；雞白痢沙門氏菌(S.pullorum，79-1)購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；檢測(cè)用培養(yǎng)基：Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)液、Glc-7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)基和Glc-7.5 % NaCl-Baird-Parker 培養(yǎng)液均由本實(shí)驗(yàn)室制備；On Call Plus 血糖儀、血糖測(cè)試條購(gòu)自艾康生物技術(shù)有限公司。

1.2 檢測(cè)用培養(yǎng)基的選擇與改進(jìn)

1.2.1 培養(yǎng)基的初步確定 基于培養(yǎng)基的選擇原則[8-11]，初步確定Baird-Parker 培養(yǎng)液和7.5 % NaCl 肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基以確保對(duì)目的菌的高選擇性，經(jīng)研究確定需要添加Glc 的適宜初始濃度后，即可作為后期研究用培養(yǎng)基，根據(jù)研究結(jié)果，經(jīng)進(jìn)一步選擇或改進(jìn)后，即可確定作為快速檢測(cè)目標(biāo)菌的專用培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種液的制備 將S.aureus 斜面菌種接種于50 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37±1 ℃下靜置培養(yǎng)20 h，作菌種培養(yǎng)液(國(guó)標(biāo)法[8]測(cè)得S.aureus 含量為108cfu/mL)。

1.2.3 培養(yǎng)基中Glc 初始濃度的選擇 在血糖儀可測(cè)Glc 濃度范圍內(nèi)，分別配制Glc 濃度為5.0 mmol/L、10.0 mmol/L、15.0 mmol/L、20.0 mmol/L 的Baird-Parker 培養(yǎng)液和7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)基各50 mL 于錐形瓶中，分別從每個(gè)錐形瓶移取5 mL 培養(yǎng)液于試管中，再分別吸取1 mL 種子液加于上述培養(yǎng)液中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間(0 h，2 h，4 h，6 h，8 h)將試管取出，通過血糖儀及其配套酶修飾電極測(cè)定培養(yǎng)物中Glc 的濃度，并計(jì)算Glc 濃度變化的差值ΔC[ΔC=C1-C2，其中C1為培養(yǎng)物中0 h 測(cè)得的Glc 濃度，C2為同一培養(yǎng)物中一定待確定測(cè)試條件(如菌液濃度、pH 值、培養(yǎng)溫度等)下培養(yǎng)一定時(shí)間測(cè)得的Glc 濃度。

1.3 菌液濃度及培養(yǎng)時(shí)間的選擇 在多支試管中分別加入5 mL 各含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基，使用生理鹽水將菌種液稀釋至濃度為101cfu/mL～108cfu/mL，分別取1 mL 加至上述試管中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)將試管取出，利用血糖儀及其配套酶修飾電極測(cè)定培養(yǎng)液中Glc 濃度。

1.4 測(cè)試底液最適pH 值的選擇 將濃度為108cfu/mL 的菌種液分別加入pH 值6.0～8.0 并含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別在0 h 和培養(yǎng)最佳檢測(cè)時(shí)間，使用血糖儀及其配套酶修飾電極測(cè)定培養(yǎng)液中Glc 濃度，計(jì)算培養(yǎng)前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并確定最適pH 值。

1.5 最適培養(yǎng)溫度的選擇 將濃度為108cfu/mL 的菌液分別加至含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，分別在30±1 ℃～45±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，在0 h和培養(yǎng)最佳檢測(cè)時(shí)間，通過血糖儀及其配套酶修飾電極測(cè)定培養(yǎng)液中Glc 濃度，計(jì)算培養(yǎng)前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并確定最適培養(yǎng)溫度。

1.6 特異性試驗(yàn) 選取濃度108cfu/mL 大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、費(fèi)式檸檬酸桿菌及腐敗希瓦氏菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。在最適條件下，采用血糖儀及其配套酶修飾電極對(duì)含有不同菌的培養(yǎng)液進(jìn)行Glc 濃度的檢測(cè)，分別在0 h和最佳培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間檢測(cè)每個(gè)菌液的Glc 濃度，計(jì)算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并對(duì)比分析，必要時(shí)進(jìn)行深入的改進(jìn)研究。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與驗(yàn)證試驗(yàn)

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將菌種液進(jìn)行101～107倍稀釋，在最適條件下，使用血糖儀及其配套酶修飾電極對(duì)不同濃度菌液培養(yǎng)物中的Glc 濃度進(jìn)行測(cè)定，分別在0 h 和最佳培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間檢測(cè)每個(gè)菌液稀釋度的Glc 濃度，計(jì)算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，對(duì)照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)BG47891.0-2010[8]計(jì)數(shù)S.aureus的含量，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)照S.aureus 國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法中第二法的Baird-Parker 平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)計(jì)數(shù)不同濃度菌液樣品，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

1.8 抗干擾性試驗(yàn) 在多支試管中分別加入5 mL含適量Glc 的7.5 % NaCl 肉湯-Baird-Parker 培養(yǎng)液，先接種濃度為108cfu/mL 的S.aureus 1 mL，再分別接種1 mL 濃度為108cfu/mL 大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、費(fèi)式檸檬酸桿菌及腐敗希瓦氏菌。以接種2 mL 濃度為108cfu/mL S.aureus 為對(duì)照?；靹蚝笾糜?7 ℃培養(yǎng)，分別在0 h和最佳培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間采用血糖儀及其配套酶修飾電極檢測(cè)每個(gè)菌液的Glc 濃度，計(jì)算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并進(jìn)行對(duì)比。

1.9 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 將市售5 種牛奶樣品共75 份，分別隨機(jī)加入S.aureus 制備人工模擬試驗(yàn)樣品，試驗(yàn)樣品中的S.aureus 濃度在101cfu/mL～105cfu/mL，采用血糖儀進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件的確定 為獲得最佳檢測(cè)效果，我們通過實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基/培養(yǎng)物中Glc 初始濃度、檢測(cè)時(shí)間、培養(yǎng)基pH 值及培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1 所示。對(duì)于培養(yǎng)基/培養(yǎng)物中Glc 初始濃度的確定，濃度為108cfu/mL 菌種液置于不同濃度的Glc-Baird-Parker 液體培養(yǎng)物和Glc-7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)物中，分別在不同時(shí)間(0 h，2 h，4 h，6 h，8 h)采用血糖儀測(cè)定培養(yǎng)物中Glc 濃度，得出的計(jì)算結(jié)果顯示，Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)物中，20.0 mmol/L的培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值(ΔC)最大、最明顯，而在Glc-7.5% NaCl 肉湯培養(yǎng)物中，Glc 初始濃度為15.0 mmol/L 時(shí)，培養(yǎng)物中ΔC 最大、最明顯。因此，結(jié)果如圖1 所示，在后續(xù)研究中選擇Baird-Parker 培養(yǎng)液的Glc 的初始濃度為20.0 mmol/L，7.5%NaCl 肉湯培養(yǎng)基的Glc 的初始濃度為15.0 mmol/L。對(duì)于檢測(cè)時(shí)間的確定，培養(yǎng)物中ΔC 隨菌液濃度的增加也相應(yīng)增大，且都隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，培養(yǎng)6 h 時(shí)Glc 濃度已與0 h 有較明顯差別，因此，確定檢測(cè)培養(yǎng)時(shí)間為6 h。如S.aureus 含量過少，培養(yǎng)6 h 后ΔC 過小難以判定時(shí)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至24 h，差值會(huì)變大而易于計(jì)數(shù)。對(duì)于適宜pH 和適宜溫度的確定，pH 值7.4 時(shí)，ΔC 值達(dá)最大，即變化最明顯，因此選擇培養(yǎng)液pH7.4。培養(yǎng)溫度為37±1 ℃時(shí)，ΔC 達(dá)最大值，因此最適培養(yǎng)溫度選擇37±1 ℃。

2.2 特異性的測(cè)定 為驗(yàn)證該方法的特異性，在最佳檢測(cè)條件下，對(duì)10 種致病菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，除B.cereus 和B.subtilis 培養(yǎng)物中ΔC 變化較大，其它幾種菌培養(yǎng)物中ΔC 變化不明顯(圖1A)，分析認(rèn)為是Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)基的選擇性不強(qiáng)所致。V.parahaemolyticus 培養(yǎng)物中ΔC 變化沒有其它幾種菌明顯，但較S.aureus 的明顯要小(圖1B)，分析認(rèn)為V.parahaemolyticus 是嗜鹽性細(xì)菌，使它培養(yǎng)物中的ΔC 變化沒其它幾種菌的ΔC 變化大，但它在此鹽濃度下受到了生長(zhǎng)抑制而導(dǎo)致消耗Glc量明顯少于S.aureus 消耗的。圖1A 和圖1B 顯示，這兩種培養(yǎng)基不能實(shí)現(xiàn)對(duì)S.aureus 嚴(yán)格的特異性選擇，而特異性是衡量檢測(cè)方法優(yōu)劣的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，好的檢測(cè)方法在特異性方面應(yīng)該達(dá)到高標(biāo)準(zhǔn)。為此，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，進(jìn)一步總結(jié)、分析和研究，設(shè)計(jì)一種新型改良培養(yǎng)液，測(cè)試結(jié)果如圖1C 所示：S.aureus 的ΔC 值遠(yuǎn)大于其它致病菌的，特異性較好。因此確定該培養(yǎng)液為血糖儀及其配套酶修飾電極測(cè)定S.aureus 的專用培養(yǎng)基，定名為“便攜式血糖儀專用改良Baird-Parker 培養(yǎng)液(PGMmodified Baird-Parker liquid culture medium)”。

表1 檢測(cè)條件的確定Table 1 Optimization of the measurement conditions

圖1 特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity tests of the PGM

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定與驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系與標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定 最佳條件下培養(yǎng)6 h 后檢測(cè)得目標(biāo)菌不同基礎(chǔ)含量與ΔC 在103cfu/mL～107cfu/mL(國(guó)標(biāo)方法測(cè)得)，與菌液濃度的對(duì)數(shù)成良好線性關(guān)系(圖2A)，線性方程：ΔC=0.74 lg[cfu·ml-1]-0.75，相關(guān)系數(shù)為0.992，檢出下限為2.6×102cfu/mL(S/N=3)。對(duì)菌含量少于檢出限者可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至24 h，菌液濃度為101cfu/mL～102cfu/mL 檢測(cè)獲得的ΔC 如圖2B 所示，保證滿足計(jì)數(shù)要求，線性方程：ΔC=2.92 lg[cfu·ml-1]-2.93，相關(guān)系數(shù)為0.993，檢出限為2.3×101cfu/mL(S/N=3)。

圖2 Glc 濃度變化(ΔC)與S.aureus 濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系Fig.2 The standard curve between the logarithmic value of S.aureus concentration and the change of the glucose concentration(ΔC)in culture medium under optimal condition

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證 將新建立的方法對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析后建立線性回歸模型(圖3)，結(jié)果表明對(duì)于S.aureus 含量在101cfu/mL～107cfu/mL 的樣品，血糖儀快速檢測(cè)法和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好，即快速檢測(cè)方法是可行的。

圖3 兩種檢測(cè)方法的對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The logarithmic standard curve by Baird-Parker and PGM

2.4 抗干擾能力檢驗(yàn) 評(píng)定在同一個(gè)培養(yǎng)物中共存的其它種類細(xì)菌可能產(chǎn)生的對(duì)血糖儀快速檢測(cè)S.aureus 結(jié)果準(zhǔn)確性的影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在S.aureus和其它幾種菌的接種量均為108cfu/mL 時(shí)，S.aureus與對(duì)照組的ΔC 差距不大(圖4)。因此，這幾種菌的存在，對(duì)S.aureus 檢測(cè)結(jié)果的影響很小，表明該檢測(cè)體系的抗干擾能力強(qiáng)。

圖4 干擾性試驗(yàn)Fig.4 Detection of S.aureus in the presence of other bacteria

2.5 準(zhǔn)確性 為驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，將人工制備的模擬樣品，在最佳條件下，分別用該方法與國(guó)標(biāo)法對(duì)各樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與國(guó)標(biāo)法相比，該方法具有較高的準(zhǔn)確率(表2)，兩者符合率為94.67 %，表明血糖儀可以用于臨床牛奶樣品中S.aureus 的檢測(cè)。

表2 國(guó)標(biāo)法與血糖儀方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)照Table 2 Comparisons of two methods for S.aureus detections

3 討論

S.aureus 是最常引起奶牛乳腺炎的細(xì)菌，在S.aureus 感染引起的奶牛乳腺炎中存在著不同程度的乳腺纖維化，嚴(yán)重的導(dǎo)致乳腺硬化，最終失去泌乳功能[1]，而且S.aureus 一旦在畜群中定植則很難或幾乎不能根除，同時(shí)它也是乳腺炎復(fù)發(fā)和使宿主機(jī)體終生帶菌的主要原因[14]。因此，對(duì)引起奶牛乳腺炎的S.aureus 進(jìn)行快速檢測(cè)十分重要，將血糖儀用于快速檢測(cè)致奶牛乳腺炎S.aureus 具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)勢(shì)。該方法將乳汁樣品直接混入改良Baird-Parker 培養(yǎng)液中，不用增菌和分純培養(yǎng)，37±1 ℃培養(yǎng)，目標(biāo)菌含量在103cfu/mL 以上培養(yǎng)6 h，在101cfu/mL～102cfu/mL 培養(yǎng)24 h，即可直接對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)計(jì)算可獲得S.aureus的定性和定量檢測(cè)結(jié)果；并且不需要貴重儀器、耗材和試劑，檢測(cè)一份樣品僅需人民幣2～3 元，不需要接觸和釋放有毒有害試劑。

本研究采用血糖儀及其配套酶修飾電極，對(duì)改良Baird-Parker 培養(yǎng)液接種待測(cè)樣品的37±1 ℃的6 h培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算，通過獲得的Glc 濃度變化的差值ΔC，對(duì)S.aureus 即可實(shí)現(xiàn)初步快速檢測(cè)，又可實(shí)現(xiàn)在103cfu/mL～107cfu/mL 濃度范圍內(nèi)的定量快速檢測(cè)，檢出限為2.6×102cfu/mL(S/N=3)；將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至24 h 再檢測(cè)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)于101cfu/mL～102cfu/mL 濃度菌液樣品的初步快速檢測(cè)，檢出限為2.3×101cfu/mL(S/N=3)。由此證明，血糖儀及其配套酶修飾電極能夠初步快速定性和定量檢測(cè)改良Baird-Parker 培養(yǎng)液6 h/24 h 培養(yǎng)物中的S.aureus，具有非常簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)的顯著突出優(yōu)點(diǎn)，為獸醫(yī)臨床對(duì)致奶牛乳腺炎S.aureus 的快速檢測(cè)提供了方法。

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