雞毒支原體HS株p MGA1.2重組蛋白的免疫保護性研究

胡思順，王曉麗，陸時娟，張金娟，李自力，許青榮，劉 梅，畢丁仁*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)引起的慢性呼吸道疾病已成為我國養(yǎng)雞業(yè)中一種重要的疾病，雞群平均感染率高達80 %[1]。盡管MG 弱毒疫苗在防控MG 中起到一定程度的作用，但弱毒疫苗株存在散毒和毒力返強的風(fēng)險[2]。因此，亟需研發(fā)更安全的疫苗以便有效的控制MG 感染。

國外的研究表明體液免疫并不能有效抵抗MG感染，而粘膜抗體(IgA)和細胞免疫可能更重要[3]。MG 黏附素蛋白pMGA 為MG 主要的抗原性蛋白，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部抗體，具有一定的粘膜免疫原性[4]。但因為沒有進一步的動物實驗數(shù)據(jù)報道，相應(yīng)的抗體是否具有免疫保護作用尚不清楚。本實驗室前期研究表明pMGA1.2 屬于HS-MG 的40 個黏附素成員之一，不顯性表達黏附素蛋白，但pMGA1.2 重組蛋白(rpMGA1.2)能夠與MG 陽性血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，表明MG 黏附素蛋白存在交叉反應(yīng)抗原表位[5-7]。本研究對pMGA1.2 對雞胚氣管粘膜的黏附特性及在MG 吸附過程的作用進行研究，同時佐以霍亂毒素B 亞單位(CTB)點眼滴鼻接種SPF雞研究pMGA1.2 的粘膜免疫能力和抗感染的應(yīng)用潛力，為進一步研究和開發(fā)MG 亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 MG-HS 株由本實驗室保存；重組質(zhì)粒pKG-pMGA1.2 和pKG-CTB 由本實驗室構(gòu)建；19 日齡SPF 雞胚購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗雞場；1 日齡艾維因肉雞購自湖北正大集團。

1.2 rp MGA1.2對MG定植雞胚氣管環(huán)粘膜的影響參照文獻[8-9]的方法無菌制備雞胚氣管環(huán)培養(yǎng)物。實驗組分3 組，分別加入50 μg、100 μg 和200 μg rpMGA1.2 孵育氣管環(huán)0.5 h，用DMEM 洗滌氣管環(huán)3 次，每次5 min，加入等量培養(yǎng)液和適量MG-HS繼續(xù)培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)24 h 和48 h 的氣管環(huán)進行電鏡掃描，參照文獻[10]的影像形態(tài)測量法，對電鏡掃描圖片反映的氣管上皮纖毛脫落程度進行評分，評價氣管環(huán)受損情況和rpMGA1.2 對MG 黏附抑制效率。同時設(shè)置PBS 處理對照組。用t 檢驗分析2 次獨立試驗結(jié)果。

1.3 rpMGA1.2粘膜免疫保護試驗 將90 只7 日齡雛雞隨機平均分成6 組，隔離飼養(yǎng)，分別進行點眼滴鼻免疫試驗和攻毒試驗。其中第1 組接種PBS，第2 組～6 組每只分別接種10 μg 空載體表達產(chǎn)物(Vector 組)、10 μg 重 組CTB(rCTB)、10 μg rpMGA1.2、10 μg rCTB+10 μg rpMGA1.2(rCTB/rpMGA1.2low)和10 μg rCTB+20 μg rpMGA1.2(rCTB/rpMGA1.2high)，免疫后第7 d 進行加強免疫一次，rpMGA1.2 劑量加倍，rCTB 劑量不變。免疫后第14 d接種MG-HS 109ccu/只。每天早晚觀察記錄雞群健康狀況，攻毒后10 d，參考文獻[11]的方法記錄實驗雞氣囊的病理變化。

1.4 樣品的采集與檢測 試驗前隨機抽取3 只雞，收集其血清、鼻腔洗液、氣管洗液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。免疫后每周每組取3 只實驗雞進行安樂死處理后收集其血清、鼻腔洗液、氣管洗液，其余雞全部翅靜脈采血，每只約0.8 mL，分離血清。處理后的樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩⑦m量MG 超聲波破碎裂解物作為包被抗原，以兔抗雞IgG-HRP(1∶2 000)或羊抗雞IgA-HRP(1∶10 000)為二抗建立ELISA 方法分別檢測抗MG 特異性抗體IgG 和MG-IgA。

2 結(jié)果

2.1 rp MGA1.2對MG定植雞胚氣管環(huán)粘膜的影響正常體外培養(yǎng)雞胚氣管環(huán)粘膜表面氣管環(huán)界限清楚、上皮細胞表面覆蓋一層規(guī)則伸展的纖毛、并有短纖毛的細胞“補丁”(圖1A-B)，表面的纖毛活力在體外培養(yǎng)9 d 后基本散失。接種MG 后24 h～48 h，氣管環(huán)間的界限模糊、粘膜表面不平、上皮細胞出現(xiàn)脫落，纖毛頂端肥大并相互粘連，出現(xiàn)不同程度脫落等病變(圖1C-D)。雞胚氣管環(huán)經(jīng)rpMGA1.2 預(yù)處理后再接種MG，MG 對氣管環(huán)的損傷作用得到抑制(圖1E-F)，實驗組與對照組差異顯著。在MG接種24 h 后，不同劑量rpMGA1.2 處理組間氣管環(huán)變化差異不顯著(p>0.05)，但在MG 接種48 h 后，高、中劑量預(yù)處理組與低劑量預(yù)處理組的氣管環(huán)變化差異顯著(p<0.05)(表1)。這表明pMGA1.2 具有抑制MG 定植雞氣管粘膜的作用。

圖1 雞胚氣管環(huán)粘膜表面纖毛電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.1 The SEM pictures of cilia on the surface of chick embryo tracheal mucosa

表1 氣管環(huán)纖毛變化情況評分結(jié)果Table 1 Results of cilia state in tracheal rings

2.2 實驗雞血清抗MG特異性IgA和IgG的檢測經(jīng)ELISA 方法檢測，結(jié)果表明，用rpMGA1.2 免疫的雞群均能夠產(chǎn)生抗pMGA1.2 抗體IgG 和IgA(圖2)，在免疫后1～3 周呈穩(wěn)定上升趨勢，與對照組(PBS 組、Vector 組、rCTB 組)差異極顯著(p<0.01)；其中rCTB 具有明顯的佐劑效應(yīng)，從免疫后第2 周開始，添加佐劑組與對照組抗體水平差異顯著(p<0.05)，但在rCTB 佐劑作用下低劑量(10 μg)比高劑量(20 μg)rpMGA1.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更強，兩組的IgG 差異顯著(p<0.05)，IgA 差異不明顯。

2.3 實驗雞鼻腔沖洗液和氣管沖洗液中IgA的檢測結(jié)果 雞鼻洗液和氣管洗液中IgA 的ELISA 檢測結(jié)果顯示，含rpMGA1.2 的免疫組均產(chǎn)生特異性IgA，其中rCTB 添加組之間差異不顯著(p>0.05)，并且以低劑量組抗體增長水平最快，但均與未添加rCTB的rpMGA1.2 組差異顯著(p<0.05)(圖3)。

圖2 血清中特異性抗體水平變化Fig.2 Titers of MG-specific antibodies in serum before and after immunization

圖3 特異性sIgA 抗體水平變化Fig.3 MG-specific sIgA antibody titers in nasal and trachea washes

2.4 rp MGA1.2免疫保護作用 對照組在攻毒后第7 d 有1～2 只雞出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀；第9 d 雞群飲食量減少、渴量明顯增加、呼吸有雜音、甩頭甚至張口伸頸呼吸。各免疫組均未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。攻毒后第10 d 剖檢實驗雞群，觀察主要臟器病理變化，對氣囊病理損傷情況進行分級評分(表2)。實驗雞群中表現(xiàn)臨床癥狀的雞的氣管內(nèi)粘液增多，氣管內(nèi)壁出現(xiàn)不同程度的出血，氣囊渾濁，不同程度增厚，其中對照組的雞病變更明顯。實驗組rpMGA1.2、rCTB/rpMGA1.2low和rCTB/rpMGA1.2high的氣囊損傷評分平均值分別為0.67、0.33 和0.50，PBS、Vector 和rCTB 對照組的氣囊損傷評分平均值分別為1.0、1.0 和0.83。根據(jù)保護率=[(對照組氣囊損傷記分-免疫組氣囊損傷記分)/對照組氣囊損傷記分]×100%計算各組保護率。實驗組rpMGA1.2、rCTB/rpMGA1.2low和rCTB/rpMGA1.2high的保護率分別為33 %、67 %和50 %。

表2 氣囊病理損傷情況記分結(jié)果Table 2 The score results about the pathological injury condition of air sac

3 討論

本實驗室利用體外雞胚氣管環(huán)培養(yǎng)模型證明rpMGA1.2 能夠競爭性結(jié)合雞氣管表面相應(yīng)的MG表面蛋白結(jié)合受體，保護氣管環(huán)免受HS(106ccu)損傷。這暗示盡管MG 粘附素是一大家簇，但其成員之間存在共同的結(jié)合受體，可能存在交叉保護作用，而且rpMGA1.2 競爭性結(jié)合器官粘膜表面的受體減少HS 的侵襲可能與rpMGA1.2 的免疫保護作用有關(guān)。本研究通過鼻腔接種實驗雞后進行免疫保護試驗，證明rpMGA1.2 具有良好的抗原活性，不僅能誘導(dǎo)粘膜免疫，產(chǎn)生特異性IgA，而且也誘導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生特異性IgY，免疫雞群獲得較好的免疫保護作用。而這種免疫作用與rCTB 作為粘膜免疫的佐劑直接相關(guān)，約10 μg 劑量rpMGA1.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能提供一定的免疫保護作用，而抗原物質(zhì)劑量過大對免疫應(yīng)答反應(yīng)卻產(chǎn)生了部分抑制，其具體原因還有待深入研究。本研究中rCTB+rpMGA1.2 免疫雞群對109ccu MG-HS 的攻擊表現(xiàn)出67.3 %的保護率，其原因一方面可能與攻毒的劑量偏大有一定關(guān)系，另一方面由于實驗動物群體數(shù)量較少，同時需要更合理的綜合評價體系，如氣管粘膜損傷評價和MG 分離，甚至病理學(xué)變化檢測。當(dāng)然，rpMGA1.2 作為疫苗候選免疫抗原的潛力還有待繼續(xù)深入研究。

本研究結(jié)果表明pMGA1.2 是潛在的亞單位疫苗抗原，其體外重組表達產(chǎn)物具有良好的抗原活性，不僅能夠競爭性的減少MG 侵襲雞胚氣管環(huán)，而且免疫雞群可以獲得較好的免疫保護作用。

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