藍舌病病毒抗原捕獲ELISA檢測方法的建立

苗海生，李 樂，廖德芳，朱建波，寇美齡，楊永欽，孫 強，李華春

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224)

藍舌病(Bluetongue，BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的BT 病毒(BTV)引起的非接觸性傳播的蟲媒病毒病，主要感染綿羊、牛及野生反芻動物。BTV廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，目前已知共有24 個血清型。近年來隨著該病主要昆蟲媒介庫蠓分布范圍的擴大、數(shù)量的增加，BT 不斷發(fā)生[1-3]。2007～2008 年間歐洲國家大規(guī)模暴發(fā)BTV-8 型疫情，并造成嚴重的的經(jīng)濟損失[4-6]。通過BT 流行病學(xué)調(diào)查，中國共在31 個省、市(區(qū))發(fā)現(xiàn)BTV 血清陽性家畜，并從云南、湖北、重慶、山西、新疆、內(nèi)蒙、廣西等地自然感染羊體中分離獲得BTV[7]。

目前在我國流行的BTV 以隱性感染為主，在流行病學(xué)調(diào)查中，將待檢動物的血液進行雞胚接種是監(jiān)測和分離獲得BTV 野生株的重要手段，因此準確快速的區(qū)別接種后雞胚的BTV 狀況對于提高抗原的分離效率和流行病學(xué)調(diào)查的準確度具有重要意義[8]。因此，本研究通過制備BTV 群特異性多克隆羊抗和兔抗血清，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了BTV 抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)檢測方法，為BTV 抗原檢測提供了一種快速、實用的檢測技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物 BTV-1 云南分離株、山羊痘病毒(GPV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、赤羽病病毒(AKAV)和BHK-21 細胞均由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存；臨床樣品為采自云南普洱、德宏地區(qū)的牛、羊肝素抗凝血液樣品；10 日齡白殼雞胚購自昆明云嶺廣大種雞場；體質(zhì)量為1.5 kg～2.0 kg 的家兔購自云南生物制藥股份有限公司實驗動物場；6～7 月齡美利奴綿羊購自南省師宗縣種羊場。

1.2 主要試劑 BTV RT-PCR 引物為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室設(shè)計，并由TaKaRa 公司合成；PS one step RT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司；HRP 標記羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TMB 購自美國BIO BASIC INC 公司。

1.3 BTV純化及高免血清的制備 將BHK-21 細胞增殖的BTV-1 采用蔗糖連續(xù)密度梯度離心(30 000 r/min、離心4 h)純化，經(jīng)ISA206 佐劑乳化，按常規(guī)方法分別在0 d、21 d、56 d 免疫兔子和綿羊，于第三次免疫后14 d 采集血清進行檢測，當中和抗體效價≥256 后采血并分離血清。

1.4 待檢樣品處理及雞胚接種 將采集的牛、綿羊肝素鈉抗凝血樣品進行離心(1 000 r/min、10 min)，棄血漿，以PBS 洗滌細胞后，重懸于雙蒸水中，1 h后，取0.1 mL 靜脈接種10 d 齡雞胚。收集2 d～7 d死亡的雞胚肝臟，加1 mL PBS 研磨離心，將經(jīng)3 000 r/min 離心后的樣品上清液作為待檢樣品。以同樣處理的陰性雞胚樣品作為對照。

1.5 AC-ELISA方法的建立

1.5.1 AC-ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 將羊抗BTV 血清和兔抗BTV 血清用稀釋液分別作1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000 倍稀釋，進行方陣交叉BTV ACELISA 檢測，確定最佳稀釋倍數(shù)。BTV 陽性雞胚肝臟上清液分別設(shè)置25 μL/孔、50 μL/孔、100 μL/孔、150 μL/孔加入量，選擇最佳待檢樣品加入量；同時對上述反應(yīng)分別設(shè)置30 min、1 h、1.5 h 反應(yīng)時間，確定各步最佳反應(yīng)時間。TMB 底物設(shè)定pH 5.6，按照每毫升底物分別加入20 μL/mL、15 μL/mL、10 μL/mL、5 μL/mL 的1% TMB 二甲基亞砜溶液配制，反應(yīng)時間分別為10 min、15 min、20 min，通過方陣交叉反應(yīng)試驗，確定最佳配方和反應(yīng)時間。根據(jù)反應(yīng)條件和劑量的優(yōu)化結(jié)果確定該檢測方法的標準操作程序。

1.5.2 判定標準的確定 利用該檢測方法同時對已知的27 份BTV 陰性雞胚樣品進行檢測，獲得陰性樣品OD450nm，計算樣品的平均OD450nm(X)和標準差(SD)，根據(jù)公式：陰陽性樣品臨界值=(X+3SD)/X，確定判定標準臨界值。

1.6 特異性試驗 將GPV、EHDV、AKAV 和BTV分別各接種1 枚雞胚，發(fā)生病變后收集雞胚肝臟。應(yīng)用AC-ELISA 方法對雞胚肝臟進行檢測，驗證該檢測方法的特異性

1.7 敏感性試驗 以BHK-21 細胞增殖BTV-1。按照OIE 規(guī)定的方法對病毒懸液進行毒價測定，Karber 法計算病毒的TCID50。將病毒懸液由1∶4 開始進行倍比稀釋至1∶2 048，采用BTV AC-ELISA 檢測方法對所有稀釋度進行檢測，確定該檢測方法的最低檢出量。同時用BTV RT-PCR 方法對各稀釋度病毒懸液進行檢測，通過二者之間的比較驗證AC-ELISA方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗 隨機抽取的8 份BTV 陽性雞胚樣品，應(yīng)用同一批次的試劑在同一ELISA 板上做3個重復(fù)，測定OD450nm值，為批內(nèi)重復(fù)性試驗；應(yīng)用3 個批次的試劑分別在3 個ELISA 板上對這8 份血清進行檢測，為批間重復(fù)性試驗。計算變異系數(shù)。

1.9 符合率試驗 應(yīng)用建立的AC-ELISA 方法和常規(guī)RT-PCR 方法對30 份接種BTV-1 的雞胚樣品和30 份BTV 陰性雞胚樣品同時進行檢測，比較二者間的符合率。

2 結(jié)果

2.1 AC-ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用方陣滴定法確定羊抗BTV 血清的最佳包被濃度(50 μL/孔)和待檢血清樣品加入量，同時按該原理對各條件進行優(yōu)化，結(jié)果如表1 所示。

2.2 判定標準的確定 利用該檢測方法檢測已知的27 份BTV 陰性雞胚樣品，測定OD450nm值，制定陰性樣品在不同OD450nm區(qū)間數(shù)量分布圖(圖1)。經(jīng)計算27 份BTV 陰性雞胚樣品X 和SD 分別為0.084和0.02，根據(jù)公式：陰陽性樣品臨界值=(X+3SD)/X=1.7，考慮到可能存在的誤差，確定陰陽性樣品試驗判定標準為2，即當樣品OD450nm/陰性對照平均OD450nm≥2 時判定為BTV 陽性，當樣品OD450nm/陰性對照平均OD450nm<2 時判定為陰性。

表1 BTV AC-ELISA 方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the BTV AC-ELISA

圖1 BTV 陰性雞胚樣品在不同OD450nm區(qū)間數(shù)量分布圖Fig.1 The assay of negative samples under OD450nm

2.3 特異性試驗 將GPV、EHDV、AKAV 和BTV 分別接種雞胚，發(fā)生病變后進行檢測。結(jié)果顯示，陰性對照平均OD450nm為0.089，GPV、AKAV與建立的AC-ELISA 方法無交叉反應(yīng)，EHDV 樣品有微量交叉反應(yīng)，但樣品OD450nm/陰性對照平均OD450nm均小于2，判定為陰性，不影響結(jié)果判定(表2)。

2.4 敏感性試驗 經(jīng)毒價檢測，確定敏感性試驗用毒毒價為105.5TCID50/50 μL，將其進行倍比稀釋后經(jīng)AC-ELISA 方法和RT-PCR 方法同時進行檢測。結(jié)果顯示，采用AC-ELISA 檢測時，病毒液稀釋至512 倍時反應(yīng)結(jié)果仍呈陽性，即最低可以檢出TCID50為102.79的病毒，而RT-PCR 方法的敏感度為1 024 倍稀釋(表3)。AC-ELISA 方法敏感性低于RT-PCR，但在實際的檢測中就檢測結(jié)果的影響微小，該差異可以忽略。

表2 特異性試驗Table 2 The specificity test of the AC-ELISA

表3 敏感性試驗檢測結(jié)果Table 3 Sensitivity test of the AC-ELISA

2.5 重復(fù)性試驗 利用3 批次試劑對8 份BTV 陽性雞胚樣品同時進行檢測，結(jié)果顯示批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.44 %～8.46 %和2.26 %～12.44 %，表明本研究建立的方法具有良好的重復(fù)性(表4)。

2.6 符合率試驗 利用建立的AC-ELISA 方法和RT-PCR 方法對30 份已知BTV 陽性和30 份已知陰性雞胚進行檢測。陽性雞胚AC-ELISA 符合率為90 %，RT-PCR 符合率為100 %，陰性雞胚符合率均為100 %。AC-ELISA 方法在判定陽性雞胚時符合率低于RT-PCR 方法(表5)。

表4 BTV AC-ELISA 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 The repeatability test of BTV AC-ELISA

表5 AC-ELISA 方法和RT-PCR 方法檢測雞胚樣品符合率比較Table 5 The coincidence rate between AC-ELISA method and RT-PCR method

3 討論

由于目前BTV 的分布具有廣泛性，為研究其流行和分布特點需要建立一種快速高效的檢測方法。雞胚接種是對野外采集的BT 病料樣品進行病毒分離的主要方法，本研究建立的AC-ELISA 方法主要針對在雞胚接種后驗證雞胚的BTV 擴增情況，由于雞胚肝臟病毒含量較高，并且易于破碎和檢測，病毒分離時多采用該部位組織。本研究的關(guān)鍵技術(shù)在于抗原的純化，并在此基礎(chǔ)上獲得高度特異性的抗體，研究發(fā)現(xiàn)BTV 顆粒在蔗糖密度梯度中主要存在于50 %～60 %密度處，在此處病毒的含量不一定最高，但純凈度卻最好。通過對27 份不同日齡BTV陰性雞胚的檢測，確立了該檢測方法的判定標準，以樣品OD450nm/陰性對照平均OD450nm=2 作為臨界值在雞胚檢測中具有較好的可靠性，在血液或其它病料樣品的實際檢測中判斷標準可以適當降低。EHDV樣品與BTV 檢測試劑有微量交叉反應(yīng)，但根據(jù)確立的判定標準并不影響結(jié)果判定，本次特異性試驗中選用的病毒為羊主要易感或同為蟲媒病的病毒，對于其它病毒的特異性試驗還需要進一步進行驗證。

BTV AC-ELISA 同樣面臨免疫原性相近已知或未知病毒非特異性反應(yīng)的影響，當相近病毒的量足夠多時也可以影響檢測結(jié)果。因此，使用BTV RT-PCR 方法和BTV AC-ELISA 方法同時對樣品進行檢測，將共同的檢測結(jié)果作為確診BTV 感染的依據(jù)更為科學(xué)。本研究建立的BTV AC-ELISA 方法可以用于BTV 分離過程中雞胚樣品的抗原陰陽性判斷，明顯提高病毒分離效率，對于BT 流行病學(xué)調(diào)查和致病性病毒株的預(yù)防具有重要意義。

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