鹽酸普萘洛爾凝膠的制備與處方優(yōu)化Δ

張麗華，黃愛文，張敏新，王 烈，宋洪濤#（.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福州 350025；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 3500）

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，發(fā)病率約為10%，其中2/3發(fā)生于頭頸部[1]。大多數(shù)血管瘤可在無任何治療干預(yù)下自發(fā)消退，最終消退率約為80%，但剩余20%的血管瘤仍會影響機(jī)體功能甚至危及生命，因此需要積極治療。血管生成因子有很多，目前已發(fā)現(xiàn)的與增生期嬰幼兒血管瘤關(guān)系最密切的是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）[2]。

口服普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤效果顯著、耐受性好，但在血管瘤治療的較長用藥周期內(nèi)仍有心率減慢、腹瀉、睡眠改變、血糖降低等不良反應(yīng)[3]。與其他給藥途徑相比，經(jīng)皮給藥更方便，且能避免口服給藥可能發(fā)生的肝臟首關(guān)效應(yīng)及全身不良反應(yīng)。有研究報(bào)道，外用普萘洛爾對淺表血管瘤有效，這提示了淺表血管瘤治療的關(guān)鍵是局部藥物濃度的高低，因此治療嬰幼兒血管瘤并不是必須使用全身給藥[4]。本課題制備了外用的鹽酸普萘洛爾凝膠，其給藥方便，避免了全身不良反應(yīng)，提高了嬰幼兒長期用藥的安全性。

1 材料

1.1 儀器

Tp-5透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸普萘洛爾對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100783-200401，純度：99.2%）；鹽酸普萘洛爾原料藥（常州亞邦制藥有限公司，批號：20100915，純度：＞98%）；羥丙甲纖維素K4M、羥丙甲纖維素K15M（上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）；泊洛沙姆407、卡波姆934、卡波姆940、卡波姆974、卡波姆1342（北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司）；十二烷基硫酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；油酸、丙二醇、水溶性氮酮、氮酮（天津博迪化工有限公司）；甘油、羥苯乙酯（南昌白云藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-十二烷基硫酸鈉溶液（7.14 g十二烷基硫酸鈉，用3 ml磷酸加水稀釋至1 000 ml，三乙胺調(diào)pH至3.0）（75 ∶25），流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：290 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液。取鹽酸普萘洛爾對照品約10 mg，精密稱定，置于250 ml量瓶中，加適量75%甲醇溶液，超聲使溶解，加75%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液，4 ℃避光保存。

2.2.2 供試品溶液。取鹽酸普萘洛爾凝膠0.033 g（約含普萘洛爾1.0 mg），精密稱定，置于50 ml量瓶中，加適量75%甲醇溶液，超聲10 min使溶解，加75%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液。取處方量不含鹽酸普萘洛爾的空白輔料0.033 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加適量75%甲醇溶液，超聲10 min使溶解，加75%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法專屬性考察

取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果理論板數(shù)按鹽酸普萘洛爾峰計(jì)為3 989，對稱因子為0.82，空白輔料對鹽酸普萘洛爾的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.鹽酸普萘洛爾Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.hydrochloride propranolol

2.4 線性關(guān)系考察

取對照品貯備液，加流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16、32 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20 μl進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：A＝21.523c－1.537 2（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸普萘洛爾檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為2～32 μg/ml；按色譜峰信噪比3計(jì)，檢測限為0.05 μg/ml；按信噪比10計(jì)，定量限為0.17 μg/ml。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

平行配制6份供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣，測定鹽酸普萘洛爾的峰面積。結(jié)果鹽酸普萘洛爾峰面積的RSD為1.82%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

取鹽酸普萘洛爾對照品約8、10、12 mg（分別為標(biāo)示量的80%、100%、120%），各3份，精密稱定，分別置于250 ml量瓶中，加入處方量空白凝膠基質(zhì)，再加適量流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過；精密移取1 ml續(xù)濾液至10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得低、中、高質(zhì)量濃度的溶液，濾過后進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算平均回收率。結(jié)果鹽酸普萘洛爾的平均回收率為98.6%，RSD為0.76%（n＝3）。

2.7 經(jīng)皮累積滲透量的測定

采用改良Franz擴(kuò)散池，將大鼠皮膚固定于供給池和接收池之間，有角質(zhì)層的一面向上。供給池中加入鹽酸普萘洛爾凝膠，接收池中加入15 ml 0.9%生理氯化鈉溶液，于1、2、3、4、5、6、7、8 h分別取樣2 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣，測定鹽酸普萘洛爾含量，同時(shí)補(bǔ)加等量的0.9%生理氯化鈉溶液。按公式計(jì)算累積滲透量[5]，式中cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度；V0為接收池的體積；ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度；V為取樣體積；A為滲透面積。以單位面積累積滲透量（Qn）為縱坐標(biāo)、滲透時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，繪制累積滲透曲線。取曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸分析，所得方程的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Js）。

2.8 處方因素考察

2.8.1 pH對鹽酸普萘洛爾經(jīng)皮滲透性的影響[6]。分別稱取鹽酸普萘洛爾原料藥1.5 g，溶于50 ml水中，用磷酸鹽緩沖液（PBS）分別調(diào)pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，加入供給池中，接收池加入15 ml 0.9%生理氯化鈉溶液，（32±1）℃保溫，分別于l、2、3、4、5、6、7、8 h從接收池中取樣2 ml，濾過后進(jìn)樣測定，同時(shí)補(bǔ)加等量等溫的0.9%生理氯化鈉溶液。結(jié)果鹽酸普萘洛爾在上述pH下8 h的累積滲透量（Q8h）分別為671.77、567.30、532.05、493.71、60.88、46.00、23.91 μg/cm2，表明在pH 4.5～7.5條件下鹽酸普萘洛爾的經(jīng)皮滲透性較好。而嬰幼兒的皮膚pH為5.0～6.5，故將處方的pH控制在5.0～6.5。

2.8.2 主藥濃度對鹽酸普萘洛爾經(jīng)皮滲透性的影響。為確定凝膠中鹽酸普萘洛爾的濃度，分別考察了1%、2%、3%、4%的鹽酸普萘洛爾水溶液對鹽酸普萘洛爾經(jīng)皮滲透性的影響。結(jié)果上述濃度鹽酸普萘洛爾水溶液Q8h分別為143.21、441.72、508.70、559.50 μg/cm2，表明主藥濃度與其經(jīng)皮滲透性呈正相關(guān)。但藥物濃度從3%增加到4%時(shí)，累積滲透量增加并不明顯，故將主藥濃度定為3%。

2.8.3 滲透促進(jìn)劑的篩選[7-8]。選擇最為常用的滲透促進(jìn)劑丙二醇、水溶性氮酮、氮酮和油酸，研究其對鹽酸普萘洛爾凝膠透皮的影響。經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)選擇促滲透效果較好的水溶性氮酮作為滲透促進(jìn)劑，并選擇其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0～3%對滲透促進(jìn)劑進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，水溶性氮酮與丙二醇合用促滲效果更好，因此處方中可加入10%丙二醇。

2.8.4 凝膠基質(zhì)的選擇。分別以不同量的卡波姆934、卡波姆940、卡波姆974、卡波姆1342、泊洛沙姆407、羥丙甲纖維素K4M、羥丙甲纖維素K15M為凝膠基質(zhì)，以凝膠的外觀、累積滲透量為考察指標(biāo)，選擇適宜的凝膠基質(zhì)并考察凝膠基質(zhì)的用量。結(jié)果表明，羥丙甲纖維素凝膠外觀透明且累積滲透量較高，故選擇羥丙甲纖維素作為凝膠基質(zhì)。在羥丙甲纖維素K4M、羥丙甲纖維素K15M中，羥丙甲纖維素K4M制備的凝膠外觀透明、黏度適宜、易涂抹，故選擇羥丙甲纖維素K4M作為凝膠基質(zhì)。羥丙甲纖維素K4M濃度為2.5%時(shí)，凝膠基質(zhì)黏度適宜；濃度小于2.5%時(shí)，凝膠基質(zhì)黏度偏??；濃度大于3.5%時(shí)，凝膠基質(zhì)黏度偏大，不易涂抹。故選擇羥丙甲纖維素K4M濃度為2.5%～3.5%。

2.8.5 保濕劑的篩選。選擇常用的保濕劑甘油、丙二醇、丁二醇、透明質(zhì)酸等，考察其在羥丙甲纖維素K4M中的保濕性能。分別加入5%甘油、10%甘油、5%丙二醇、5%丁二醇、0.2%透明質(zhì)酸作為保濕劑，制備凝膠[9]。將所制得的凝膠用醫(yī)用注射器以2 ml/cm2的劑量，均勻涂抹于同等大小的3M膜上，涂抹面積約2 cm×2 cm，將涂有凝膠的3M膜放置于相對濕度（RH）為23%、43%、84%的環(huán)境中，25 ℃條件下放置48 h后精確稱取各樣品，根據(jù)放置后樣品的質(zhì)量差計(jì)算失水率，由失水率評價(jià)其保濕性能。結(jié)果表明，10%甘油具有較好的保濕性能，因此擬選擇10%甘油作為凝膠劑的保濕劑，結(jié)果見表1。

表1 保濕劑的篩選結(jié)果（48 h失水率，%）Tab 1 The selection of moisturizing agents（48 h rate of water loss，%）

2.9 制備工藝

稱取處方量羥丙甲纖維素K4M加適量超純水?dāng)嚢杈鶆蛉苊涍^夜備用，即為基質(zhì)A；另稱取處方量的鹽酸普萘洛爾原料藥溶于適量水中為溶液1，稱取羥苯乙酯加甘油溶解再將處方量滲透促進(jìn)劑水溶性氮酮、丙二醇加入攪勻?yàn)槿芤?；將溶液1、溶液2緩緩加入溶脹好的基質(zhì)A中，加水至100 g，攪拌至均勻即得。

2.10 處方優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，以Q8h和Js為指標(biāo)，對滲透促進(jìn)劑水溶性氮酮（A）、凝膠基質(zhì)羥丙甲纖維素K4M的濃度（B）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平取值見表2，結(jié)果見表3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素水平取值Tab 2 Factors and levels in central composite design test

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果Tab 3 Results of central composite design test

根據(jù)擬合優(yōu)度（r最大）和置信度（P＜0.05）分別對各擬合方程進(jìn)行判斷，最終得到最優(yōu)方程均為二次多項(xiàng)式方程，即：Q8h＝140.20+127.60A+135.93B+6.21AB－44.89A2－47.21B2（r＝0.946 6，P＜0.05），Js＝1.98+26.16A+23.44B－2.41AB－45.59A2－6.36B2（r＝0.941 5，P＜0.05）。采用Origin Pro.8軟件繪制以上擬合方程的三維效應(yīng)面和二維等高線圖，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 A、B對Q8h的量效應(yīng)面圖和等高線圖Fig 2 The response surface and contour lines of A and B to

圖3 A、B對Js的量效應(yīng)面圖和等高線圖Fig 3 The response surface and contour lines of A and B toJs

由圖2、圖3可知，隨著基質(zhì)濃度的增加，Q8h、Js反而減??；隨著水溶性氮酮濃度的增加，Q8h、Js先增加后減小。將回歸結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，對鹽酸普萘洛爾凝膠體外經(jīng)皮滲透性能影響的主次順序?yàn)锽＞A，即羥丙甲纖維素K4M濃度對鹽酸普萘洛爾凝膠體外經(jīng)皮滲透性能的影響（P＜0.05）大于水溶性氮酮濃度的影響（P＞0.05）。軟件系統(tǒng)提供的優(yōu)化方案為：①A：1.80%，B：2.54%；②A：1.81%，B：2.50%；③A：1.64%，B：2.61%。結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，再綜合考慮到取得相同效果前提下加入最少量滲透促進(jìn)劑的原則，最終處方（100 g）定為：鹽酸普萘洛爾3%（3 g）、羥丙甲纖維素K4M 2.61%（2.61 g）、水溶性氮酮1.64%（1.64 g）、丙二醇10%（10 g）、甘油10%（10 g）、羥苯乙酯0.1%（0.1 g），pH控制為5.0～6.5。

2.11 處方驗(yàn)證

按照最終處方配制3批鹽酸普萘洛爾凝膠，分別測定其Q8h和Js，通過比較實(shí)測值與預(yù)測值，對模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表6。結(jié)果3批樣品的Q8h和Js的預(yù)測值與實(shí)測值之間的誤差均小于5%，表明建立的模型具有良好的預(yù)測性，可用于凝膠處方的優(yōu)選。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of validation tests

3 討論

本研究在預(yù)試驗(yàn)中分別考察了鹽酸普萘洛爾及普萘洛爾在不同pH條件下的溶解度、油水分配系數(shù)和各自的Q8h。理化性質(zhì)研究表明，在不同pH條件下鹽酸普萘洛爾的溶解度均大于普萘洛爾，尤其在pH 5.0～6.5時(shí)，隨著pH的增加，鹽酸普萘洛爾溶解度與普萘洛爾溶解度的比值逐漸增大；不同pH條件下普萘洛爾的lgP均高于鹽酸普萘洛爾，但在pH 5.0～6.5時(shí)，二者的差距隨著pH的增加逐漸縮小。為進(jìn)一步考察何種原料藥更適合做成外用凝膠劑，筆者分別將兩種原料藥按照相同處方制備成乳劑，并將pH控制在5.0～6.5進(jìn)行體外滲透試驗(yàn)，結(jié)果表明鹽酸普萘洛爾乳劑的Q8h為（203.31±35.21）μg/cm2，而普萘洛爾乳劑的Q8h為（171.27±43.13）μg/cm2。因此，最終選擇鹽酸普萘洛爾作為原料藥制備凝膠劑。

皮膚是限制體外物質(zhì)吸收進(jìn)入體內(nèi)的生理屏障，大多數(shù)藥物透過該屏障的速度都很小，一般給藥后幾小時(shí)才能起效，且多數(shù)藥物不能達(dá)到有效治療濃度，尤其是水溶性藥物的皮膚透過率極低。鹽酸普萘洛爾為水溶性藥物，其治療嬰幼兒血管瘤療效確切，若能提高其經(jīng)皮滲透量，使其在皮膚中形成貯庫，既能使藥物更好地治療局部疾病，又能避免口服給藥可能發(fā)生的肝臟首關(guān)效應(yīng)及全身不良反應(yīng)。因此，選擇合適的滲透促進(jìn)劑在相同給藥劑量下可提高療效。楊柳等[10]報(bào)道了氮酮、油酸、丙二醇、氮酮與油酸混合物、氮酮與丙二醇混合物、油酸與丙二醇混合物這6種滲透促進(jìn)劑對鹽酸普萘洛爾乳膏透皮性能的影響，結(jié)果表明這6種滲透促進(jìn)劑均可增強(qiáng)鹽酸普萘洛爾局部給藥的透皮吸收作用，其中以油酸的促滲透作用最好。而本研究結(jié)果則顯示，水溶性氮酮對鹽酸普萘洛爾凝膠的促滲作用較強(qiáng)。這是因?yàn)樗苄缘c乳膏基質(zhì)中的凡士林具有較強(qiáng)的親和力，降低了其向角質(zhì)層分配的比例，從而影響了促滲效果。而本研究選擇了凝膠這一劑型，排除了凡士林的干擾，并且由于水溶性氮酮對于親水性藥物的促滲作用強(qiáng)于親脂性藥物，因此本研究中水溶性氮酮對鹽酸普萘洛爾凝膠的促滲作用最強(qiáng)。

在凝膠基質(zhì)的選擇上，分別考察了卡波姆、泊洛沙姆和羥丙甲纖維素這3種材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同型號的卡波姆與鹽酸普萘洛爾混合，當(dāng)加入三乙醇胺調(diào)節(jié)基質(zhì)pH時(shí)，由于三乙醇胺與藥物發(fā)生了中和反應(yīng)，使得藥物析出，并產(chǎn)生分層現(xiàn)象，故卡波姆不適合作為鹽酸普萘洛爾凝膠的基質(zhì)。泊洛沙姆作為凝膠基質(zhì)，藥物的累積滲透量偏低，表明泊洛沙姆可能阻礙了藥物的釋放。以羥丙甲纖維素為基質(zhì)制備的凝膠外觀透明且累積滲透量較高，故選擇羥丙甲纖維素作為凝膠基質(zhì)。

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