咪喹莫特乳膏的體外透皮吸收研究

於學良，張根元（1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 15009；.南京工業(yè)大學江蘇省藥物研究所有限公司，南京 10009）

咪喹莫特（Imiquimod）化學名稱為1-異丁基-4-氨基-1H-咪唑并[4，5-C]喹啉，分子式為C14H16N4，能夠在用藥局部誘導生成多種細胞因子及相關產物，產生免疫調節(jié)和間接抗病毒作用，臨床上用于治療成人外生殖器和肛門的疣/尖銳濕疣[1]。咪喹莫特在國內屬于國家二類新藥，主要劑型為乳膏劑。經(jīng)查閱相關文獻資料，未見報道咪喹莫特乳膏的透皮吸收研究。本文采用體外擴散池法，選用斷奶1～10 d的小型豬背部皮膚模擬人體皮膚進行透皮吸收研究，以制劑中咪喹莫特透皮吸收量為指標，建立了以反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測咪喹莫特體外透皮吸收量的方法。結果表明，該方法能使樣品得到較好的分離，排除輔料的干擾，且操作快速、簡便、準確、重復性好，適用于產品的質量控制和體外透皮吸收量的檢測。本文為外用制劑的體外透皮吸收提供了一個較好的研究方法，并為本品供皮膚局部使用提供了臨床科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Alltech 626型HPLC儀（美國Alltech公司）；YB-P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

咪喹莫特對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100632-200401，純度：98%）；咪喹莫特乳膏（批號：20090801、20090802、20090803，規(guī)格：150 mg∶3 g）、空白乳膏均由江蘇中丹制藥有限公司提供；進口咪喹莫特乳膏（商品名：艾達樂，美國3M Health Care有限公司，批號：GKE069C，規(guī)格：12.5 mg∶250 mg）；甲醇、磷酸二氫鉀、聚乙二醇400（PEG400，批號：090616）均由上海凌峰化學試劑有限公司提供，均為化學純。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 離體皮膚的制備

取小型乳豬，頸動脈放血處死，剝離背部皮膚，分離皮下組織及脂肪，用生理氯化鈉溶液洗凈，置于生理氯化鈉溶液中，冷凍保存，1周內使用。

2.2 檢測波長的確定

取咪喹莫特對照品適量，用“2.3”項下流動相溶解并稀釋制成每1 ml中約含3μg的溶液，在200～400 nm波長范圍內進行掃描。結果咪喹莫特在流動相溶液中于244 nm波長處有最大吸收，故選擇244 nm作為檢測咪喹莫特透皮吸收量的檢測波長。

2.3 透皮吸收試驗方法

采用Franz擴散池與YB-P6智能透皮試驗儀。從冰箱中取出離體豬皮，在室溫下化凍，固定于擴散池的給藥室與接收室之間，內徑1.8 cm，接收室容積約17 ml，磁轉子轉速300 r/min。擴散池一端用離體豬皮覆蓋，使皮膚表層面向給藥室，真皮一側與接收液接觸。精密稱取咪喹莫特乳膏1.0 g，置給藥室中涂抹均勻，并與皮膚密切接觸。經(jīng)預試驗結果選定咪喹莫特透皮吸收的接收液為20%PEG400生理氯化鈉溶液（取20 ml PEG400，加生理氯化鈉溶液稀釋至100 ml），水浴溫度為37 ℃。在水浴溫度達到預置溫度時開始計時，分別于1、2、4、6、8、12、24 h取接收室中的接收液1 ml，同時立即向接收室中補充等體積同溫度的接收液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-85%磷酸（48∶52∶0.2，V/V/V），流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：244 nm；進樣量：50 μl。

2.5 空白輔料的干擾試驗

取離體豬皮，均勻地涂鋪空白乳膏1.0 g，置透皮吸收試驗裝置中，以20%PEG400生理氯化鈉溶液17 ml作為接收液，于24 h取樣1 ml，精密量取空白乳膏接收液50 μl注入液相色譜儀，記錄色譜；另取咪喹莫特對照品溶液及24 h的透皮吸收供試品溶液，分別進樣，記錄色譜。色譜圖見圖1。

圖1 反相高效液相色譜圖A.空白乳膏；B.對照品；C.供試品；1.咪喹莫特Fig 1 RP-HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.substance control；C.test sample；1.imiquimod

由圖1可見，咪喹莫特主峰的出峰時間約為6.5 min，空白乳膏在咪喹莫特主峰處無色譜峰出現(xiàn)，即空白乳膏對透皮接收液中咪喹莫特透皮吸收量的測定無干擾。供試品溶液中咪喹莫特主峰后有1個峰，二者分離度為2.62，符合《中國藥典》相關要求，說明空白輔料對咪喹莫特的測定無干擾。

2.6 檢測限與定量限考察

取咪喹莫特對照品適量，加適量甲醇溶解后，用20%PEG400生理氯化鈉溶液配制成一定濃度的稀溶液，按信噪比為3和10分別測定檢測限及定量限。結果咪喹莫特的檢測限為0.05 ng，定量限為0.15 ng。

2.7 線性關系考察

取咪喹莫特對照品約10 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后，定容，搖勻。精密量取5 ml，置于50 ml量瓶中，加20%PEG400生理氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取0.5、1.0、2.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加20%PEG400生理氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，制成0.5、1.0、2.0 μg/ml的溶液。精密量取0.5 μg/ml的溶液適量，用20%PEG400生理氯化鈉溶液稀釋并制成0.01、0.05、0.1μg/ml的溶液，精密量取上述6種質量濃度的溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜。以質量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸分析，得回歸方程為A＝3.052 2×103+2.302 9×105c（r＝0.999 2，n＝6）。結果表明，咪喹莫特在20%PEG400生理氯化鈉溶液中檢測質量濃度的線性范圍為0.01～2.0 μg/ml。

2.8 進樣精密度試驗

取“2.7”項下質量濃度為0.5μg/ml的咪喹莫特對照品溶液50 μl，重復進樣5次，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.3%（n＝5），表明儀器進樣精密度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗

取咪喹莫特對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后，用空白乳膏24 h的皮膚接收液稀釋并制成質量濃度為0.2μg/ml的供試品溶液，室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后，各精密量取50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，考察咪喹莫特在透皮接收液中的穩(wěn)定性。結果峰面積的RSD為0.45%（n＝7），表明咪喹莫特在透皮接收液中24 h內穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗

取咪喹莫特對照品約10 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后，精密量取5 ml，置于50 ml量瓶中，加空白乳膏24 h的皮膚接收液稀釋至刻度，搖勻，制成咪喹莫特質量濃度分別為0.05、0.1、1μg/ml的供試品溶液。各取50 μl上述供試品溶液分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，代入回歸方程計算濃度和回收率。結果低、中、高質量濃度的回收率分別為98.67%（RSD＝2.6%）、99.65%（RSD＝0.63%）、99.36%（RSD＝0.41%），平均回收率為99.23%（RSD＝0.51%，n＝3），表明咪喹莫特在透皮接收液中測定的準確度較好。

2.11 樣品體外透皮率考察

精密量取“2.2”項下透皮接收液50 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積，代入回歸方程計算各取樣點的咪喹莫特濃度，并按下列公式計算單位面積累積透皮量（Q）和穩(wěn)態(tài)滲透速率常數(shù)（Js）。Q＝（cnV+∑ciVi）/A[2]，式中cn為各取樣時間點樣品中咪喹莫特的質量濃度，V為接收室體積，ci為各取樣時間點前次取樣液中咪喹莫特的質量濃度，Vi為取樣體積，A為擴散池面積。以Q對滲透時間t進行線性回歸分析，所得斜率即為Js。根據(jù)以上Q值，即可計算出咪喹莫特乳膏的累積滲皮率＝Q/W×100%[2]，式中W為取樣的樣品中所含主藥咪喹莫特的質量。3批樣品與進口對照藥的體外透皮結果見表1，累積透皮率-時間曲線見圖2。

表1 咪喹莫特乳膏體外透皮結果Tab 1 Transdermal permeation of Imiquimod cream

由表1和圖2結果可知，咪喹莫特乳膏3批樣品與進口對照藥的透皮吸收情況基本一致，24 h的累積透皮率平均值均小于0.1%，故可認為咪喹莫特乳膏作為外用皮膚藥，僅為局部作用而非全身吸收作用。

3 討論

圖2 咪喹莫特乳膏的累積透皮率-時間曲線Fig 2 Accumulative penetration rate-time curve of Imiquimod cream

據(jù)相關文獻報道，透皮吸收常用的實驗動物主要有小鼠、豚鼠、大鼠、豬、家兔及蛇[3]；剛斷奶的乳豬與人體皮膚層次結構和滲透性最接近，是理想的皮膚模型[4]；特別是剛斷奶的豬背皮膚與人的前臂皮膚最接近，且小型豬的皮膚與人的穿透性特征最接近[5]。

皮膚外用藥物進行透皮吸收試驗，其接收液主要采用生理氯化鈉溶液、30%乙醇-生理氯化鈉溶液、聚乙二醇-生理氯化鈉溶液（20∶80）、pH 6.8及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液、10%聚山梨酯80的生理氯化鈉溶液等[6-7]。但筆者前期經(jīng)溶解度試驗發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特幾乎不溶于生理氯化鈉溶液、30%乙醇-生理氯化鈉溶液和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液。故筆者參照文獻[8-9]，采用20%PEG400生理氯化鈉溶液作為透皮接收液，發(fā)現(xiàn)可達到藥物溶出介質所需的漏槽條件，結果可靠。

本試驗建立了RP-HPLC法檢測咪喹莫特乳膏體外透皮量的方法，該方法快速、靈敏、準確、可靠，為外用制劑的體外透皮吸收提供了一個較好的研究方法。

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