一株海洋真菌BY1產(chǎn)伸筋草醇發(fā)酵條件的優(yōu)化

王　凱，紀仁飛，李愛貞

(集美大學食品與生物工程學院， 福建 廈門 361021)

一株海洋真菌BY1產(chǎn)伸筋草醇發(fā)酵條件的優(yōu)化

王凱，紀仁飛，李愛貞*

(集美大學食品與生物工程學院， 福建 廈門 361021)

摘要：伸筋草醇(Clavatol)是具有多種生物活性的聚酮類三萜醇化合物。本文采用HPLC法分析海洋真菌BY1發(fā)酵產(chǎn)物中伸筋草醇的產(chǎn)量，研究不同培養(yǎng)基、海水濃度、培養(yǎng)天數(shù)、裝液量對BY1菌株產(chǎn)伸筋草醇的影響。結(jié)果表明，海洋真菌BY1產(chǎn)伸筋草醇的發(fā)酵條件為：接種量1.0 mL種子發(fā)酵液，250 mL三角瓶裝海水濃度為20% (v/v)的70 mL麥芽汁培養(yǎng)基(MA培養(yǎng)基)，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)9 d。

關鍵詞：海洋真菌；伸筋草醇；發(fā)酵條件

海洋真菌分為專性海洋真菌和兼性海洋真菌兩大類。其中專性海洋真菌是指只能夠在大洋和河口地區(qū)生長和形成孢子的真菌，而兼性海洋真菌是指那些雖然來自淡水和陸地環(huán)境，但是能在海洋環(huán)境中生長和形成孢子的真菌[1]。海洋真菌為了適應海洋獨特的生存環(huán)境，可代謝產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑制細胞周期、及拮抗血小板活化因子等不同生物活性的化合物[2-7]。

伸筋草醇(Clavatol)是首先發(fā)現(xiàn)于傳統(tǒng)中藥伸筋草中的一種聚酮類三萜醇化合物(圖1)[8]，具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、治療類風濕性關節(jié)炎、預防性治療實驗性矽肺、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物作用及抑制乙酰膽堿酯酶等活性[9,10]。本實驗室從福建省廈門市集美區(qū)紅樹植物海馬齒(Sesuviumportulacastrum)中分離到一株海洋真菌BY1，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到化合物伸筋草醇，本文采用HPLC分析菌株BY1發(fā)酵產(chǎn)物中伸筋草醇的產(chǎn)量，研究菌株BY1產(chǎn)伸筋草醇的發(fā)酵條件，為提高菌株BY1發(fā)酵產(chǎn)物中伸筋草醇的產(chǎn)量提供理論依據(jù)和技術支持。

圖1　伸筋草醇的化學結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of Clavatol

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源

菌株BY1分離自福建省廈門市集美區(qū)紅樹植物海馬齒(Sesuvium portulacastrum)中。

1.1.2主要試劑

伸筋草醇標準品 (95%)；高效液相色譜用甲醇為色譜純，購于美國天地公司；蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿為生化試劑，購于上海華美生物公司；甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、NaNO3、K2S2O8、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、蔗糖、葡萄糖等均為分析純，購于國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基

1)麥芽汁液體培養(yǎng)基(MA)：500 mL麥芽汁，500 mL蒸餾水。121℃滅菌20 min后備用。

2)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1000 mL。121℃滅菌20 min后備用。

3)察氏培養(yǎng)基(CZA)：硝酸鈉3.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，氯化鉀0.5 g，葡萄糖30.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min后備用。

4)酵母蔗糖培養(yǎng)基(YES)：酵母膏20.0 g，蔗糖150.0 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min后備用。

5)淀粉培養(yǎng)基(SYE)：可溶性淀粉15.0 g，酵母膏4.0 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min后備用。

6)高氏Ⅰ號培養(yǎng)基(NA)：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4，121℃、滅菌20 min后備用。

1.1.4主要儀器設備

ZWY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)；薄層硅膠 GF254 (青島譜科分離材料有限公司)；Agilent 1260系列高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1種子發(fā)酵液制備

制備麥芽汁固體培養(yǎng)基平板，將菌株BY1以劃線法接種到平板中，28 ℃培養(yǎng)3 d，從平板上切取生長一致的1 cm2的菌絲塊(3塊)接種到麥芽糖液體培養(yǎng)基中(100 mL/250 mL三角瓶)，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，制成種子發(fā)酵液[11]。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物的制備

吸取1.0 mL種子發(fā)酵液至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)。將搖瓶發(fā)酵液經(jīng)過減壓抽濾，收集菌體和發(fā)酵液上清。將發(fā)酵液上清用等體積乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并發(fā)酵液上清乙酸乙酯相，減壓濃縮后稱重，甲醇溶解備用。

1.2.3生物量的測定

取干燥的培養(yǎng)皿準確稱重(G1)，將抽濾所得菌體置于培養(yǎng)皿內(nèi)，將菌體連同培養(yǎng)皿置于烘箱中，100 ℃干燥至恒重，在干燥器中冷卻至室溫，準確稱重 (G2)，根據(jù)G1與G2算出菌體干重W(g/ L)[12]，即得生物量。

1.2.4ABTS法測定抗氧化活性

測定方法參考Re等[13]的報道略做改變：稱取一定質(zhì)量的2，2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)加蒸餾水配制成7 mmol/L 的ABTS水溶液，稱取一定質(zhì)量的K2S2O8用蒸餾水配制成45 mmol/L 的K2S2O8水溶液，將配制好的兩種溶液按1∶1 的比例混合均勻，常溫避光下放置12-16 h，即得到ABTS+溶液。測定時用先用甲醇將ABTS+溶液稀釋至波長為734 nm 時吸光度為0.700±0.02的濃度，反應時發(fā)酵產(chǎn)物試液與ABTS+稀釋溶液以1∶20的比例混合，30 ℃恒溫水浴下反應6 min，在734 nm 下測定其吸光度Ax；空白以同體積的甲醇代替代謝產(chǎn)物試液，同樣波長下測定吸光度A0。每個濃度3 個平行，清除率以下式計算：

1.2.5標準曲線的繪制

用甲醇作溶劑，分別配置濃度為10、15、20、25、30、40、50 μg/mL的伸筋草醇標準品，在1.2.5的高效液相色譜條件下，測定各濃度在280 nm下的吸收峰面積。以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.6HPLC分析伸筋草醇的產(chǎn)量

利用外標法分析伸筋草醇的產(chǎn)量。色譜條件為 C18(Waters ODS，4 μm，4.6×25 cm)色譜柱；紫外檢測波長：280 nm；流動相：甲醇-超純水(95∶5)；流速：0.5 mL/min，進樣量15 μL，進樣間隔時間15 min，通過標準曲線計算伸筋草醇產(chǎn)量。

2結(jié)果與分析

2.1伸筋草醇(Clavatol)標準曲線

圖2　伸筋草醇的HPLC色譜圖Fig.2　The HPLC chromatograms of clavatol

圖3　伸筋草醇含量-峰面積標準曲線Fig.3　Thes standard curve of the content-peak area of clavatol

在1.2.5的色譜條件下，HPLC分析法測定的伸筋草醇保留時間為6.68 min，峰面積達到100%(圖2)。將不同濃度的伸筋草醇標準溶液，在上述色譜條件下進行分析，制得標準曲線為y=122.5x+264.49，標準曲線的線性相關系數(shù)為0.9945(圖3)，結(jié)果表明峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好的線性關系。

2.2不同培養(yǎng)基的選擇

選取不同培養(yǎng)基(YES、MA、CZA、SYE、NA和PDB各100 mL)發(fā)酵菌株BY1，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)9 d，以抗氧化活性、生物量和伸筋草醇的產(chǎn)量為指標，對菌株BY1的發(fā)酵培養(yǎng)基進行選擇。

菌株BY1不同培養(yǎng)基的抗氧化活性測定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，菌株BY1不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物在濃度為1 mg/mL時，抗氧化活性差別較大。MA培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最強，對ABTS+自由基清除率為100%；SYE培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性次之，對ABTS+自由基清除率為71.63%；YES培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最低，對ABTS+自由基清除率僅為17.66%。

表1菌株BY1不同培養(yǎng)基發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性分析(ABTS法)

Tab.1The antioxidant activity of extract from different fermentation media of strain BY1 (the method of ABTS)

培養(yǎng)基清除率(%)10mg/mL1mg/mLYES97.1217.66MA100100CZA10030.00SYE10071.63NA10064.89PDB10053.37

圖4　不同培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后的生物量和伸筋草醇的產(chǎn)量Fig.4　 The yield of biomass and clavatol under in different medium after 9 days

菌株BY1不同培養(yǎng)基的生物量和伸筋草醇產(chǎn)量測定結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，菌株BY1不同培養(yǎng)基的生物量和伸筋草醇產(chǎn)量差別較大。MA培養(yǎng)基菌體的生物量最大，為10.47 g/L；CZA培養(yǎng)基菌體的生物量次之，為7.49 g/L；PDB培養(yǎng)基菌體的生物量最小，為0.65 g/L。NA培養(yǎng)基伸筋草醇的產(chǎn)量最高，為2040.22 mg/L；MA培養(yǎng)基伸筋草醇的產(chǎn)量次之，為720.51 mg/L；CZA培養(yǎng)基伸筋草醇的產(chǎn)量最低，為40.43 mg/L。

綜上，NA培養(yǎng)基伸筋草醇的產(chǎn)量雖然最高，但其菌體生物量較少，僅為0.78 g/L，因此伸筋草醇總產(chǎn)量較低；而MA培養(yǎng)基伸筋草醇的產(chǎn)量僅次于NA培養(yǎng)基，菌體生物量最大，因此伸筋草醇總產(chǎn)量最高。再結(jié)合MA培養(yǎng)基抗氧化活性最強的實驗結(jié)果，選擇MA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基進行進一步的單因素優(yōu)化實驗。

2.3不同海水濃度對伸筋草醇(Clavatol)產(chǎn)量的影響

圖5　不同海水濃度下伸筋草醇的產(chǎn)量Fig.5　Production of clavatol in different concentration of seawater

選取不同海水濃度(0%、10%、20%、30%和40%)的MA培養(yǎng)基發(fā)酵菌株BY1，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)9 d，研究不同海水濃度對伸筋草醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，海水濃度從0%增加到40%的過程中，伸筋草醇的產(chǎn)量為先增加后減少的趨勢，海水濃度為0%~20%時，隨著海水濃度的增加，伸筋草醇的產(chǎn)量增大，海水濃度為20%時，伸筋草醇的產(chǎn)量達到最大值，為565.7 mg/L；海水濃度為30%~40%時，隨著海水濃度的增加，伸筋草醇的產(chǎn)量減少，海水濃度為40%時，伸筋草醇的產(chǎn)量下降到381.3 mg/L。因此選擇海水濃度20%(v/v)為最佳濃度。

2.4不同培養(yǎng)天數(shù)對伸筋草醇(Clavatol)產(chǎn)量的影響

圖6　不同培養(yǎng)天數(shù)下伸筋草醇的產(chǎn)量Fig.6　Production of clavatol in the different number of days

應用100 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶發(fā)酵菌株BY1，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)5 d~14 d，研究不同培養(yǎng)天數(shù)對伸筋草醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，培養(yǎng)天數(shù)為5 d~9 d時，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，伸筋草醇的產(chǎn)量增大，培養(yǎng)天數(shù)為9 d時，伸筋草醇的產(chǎn)量達到最大值，為598.4 mg/L；培養(yǎng)9 d后，伸筋草醇的產(chǎn)量下降，當培養(yǎng)天數(shù)為14 d時，伸筋草醇的產(chǎn)量最低，為158.6 mg/L。因此選擇培養(yǎng)天數(shù)9 d為最佳天數(shù)。

2.5不同裝液量對伸筋草醇(Clavatol)產(chǎn)量的影響

圖7　不同裝液量下伸筋草醇的產(chǎn)量Fig.7　Production of Clavatol in the different loaded liquid

選取不同裝液量(50 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶~ 110 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶)發(fā)酵菌株BY1，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)9 d，研究不同裝液量對伸筋草醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，裝液量為50 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶~70 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶時，隨著裝液量的增加，伸筋草醇的產(chǎn)量增大，裝液量為70 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶時，伸筋草醇的產(chǎn)量達到最大值，為753.0 mg/L，裝液量為80 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶~ 110 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶時，隨著裝液量的增加，伸筋草醇的產(chǎn)量減少，裝液量為110 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶時，伸筋草醇的產(chǎn)量最低，為80.5 mg/L。因此選擇裝液量70 mL MA培養(yǎng)基/250 mL三角瓶為最佳裝液量。

3結(jié)論

對海洋真菌BY1產(chǎn)伸筋草醇的發(fā)酵條件進行單因素優(yōu)化，確定發(fā)酵條件為：接種量1.0 mL種子發(fā)酵液, 250 mL三角瓶裝海水濃度為20%(v/v)的70 mL麥芽汁培養(yǎng)基(MA培養(yǎng)基)，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)9 d。

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Optimization of Fermentation Condition of Clavatol Produced by a Marine Fungus BY1

WANGKai,JIRenfei,LIAizhen*

(College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, Fujian, China)

Abstract：Clavatol is a polyketide and triterpene alcohol compound that has a variety of biological activities. This article used HPLC to analyse the Clavatol production in fermentation products of marine fungus BY1 strain, and research the influences on the yield of Clavatol in different media, concentration of seawater, culture days, and different loaded liquid. The optimal medium was Maltose medium (MA) with seawater concentration 20% (v/v) and the optimal culture condition was 70 mL medium in 250 mL triangular flask, inoculum 1.0 mL seed fermented liquid, temperature 28 ℃ and incubation time 9 days under the condition of oscillation at 180 r/min.

Key words：marine fungus; clavatol; fermentation condition

文章編號：1007-7146(2015)06-0551-05

文獻標志碼：A

中圖分類號：Q932

*通訊作者：李愛貞(1964-)，女，湖南漣源人，集美大學副教授，博士，微生物學方向。(手機)13779921643；(電子郵箱)azli@ jmu.edu.cn

作者簡介：王凱 (1989-)，男，河南安陽人，碩士研究生，主要從事天然化合物分離純化及生物活性研究。(手機)15659836808；(電子郵箱)yuetadakai@163.com

基金項目：福建省教育廳項目(JB12140)

收稿日期：2015-04-10;修回日期:2015-05-10

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.011