長(zhǎng)江、黃河和遼河水系中華絨螯蟹野生和養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析*

劉 青 劉 皓 吳旭干 何 杰 董鵬生 王幼鵬 成永旭①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 太谷

030801; 3. 上海海洋大學(xué) 上海市教委水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306; 4. 江蘇省宿遷旭邦水產(chǎn)科技有限公司泗洪 223900)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹(以下簡(jiǎn)稱河蟹),是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖種類,2012年全國(guó)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)714400 t (王武等,2013)。我國(guó)河蟹天然群體曾廣泛分布于遼河、黃河、長(zhǎng)江、甌江和閩江等水系,野生資源豐富(許加武等,1997; Suiet al,2009)。但是,20世紀(jì)70年代以來,由于過渡捕撈、入海和沿江河流的水閘阻擋河蟹洄游通道及環(huán)境污染等原因,各水系河蟹野生資源急劇下降,成蟹捕撈產(chǎn)量逐年下降,難以滿足市場(chǎng)需求(Chenget al,2008)。另一方面,隨著人們生活水平的提高,河蟹的消費(fèi)量不斷增加,這種狀況極大促進(jìn)了河蟹增養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展(Suiet al,2011)。20世紀(jì)80年代河蟹人工育苗技術(shù)取得突破以后,其人工養(yǎng)殖在我國(guó)大部分地區(qū)得以迅速發(fā)展,目前養(yǎng)殖較集中的區(qū)域?yàn)殚L(zhǎng)江流域、黃河流域和遼河流域,其中長(zhǎng)江流域養(yǎng)殖規(guī)模、總產(chǎn)量和成蟹平均規(guī)格均占首位(崔江華,2010;王武等,2013; 趙娜,2014)。由于不同水系河蟹的養(yǎng)殖性能和蟹種價(jià)格相差較大(李勇等,2001; 李晨虹等,2002),通常認(rèn)為長(zhǎng)江水系河蟹養(yǎng)殖性能最佳,因此20世紀(jì)90年代其它水系的河蟹蟹種被引入長(zhǎng)江流域滿足蟹種需求的缺口; 另一方面,長(zhǎng)江水系蟹種也被引入黃河和遼河流域進(jìn)行池塘養(yǎng)殖希望獲得更好的養(yǎng)殖效果,這種水系間的盲目引種及養(yǎng)殖導(dǎo)致河蟹種質(zhì)混雜、養(yǎng)殖性能退化(王武等,2007)。此外,河蟹人工繁育過程中,許多育苗場(chǎng)為了降低親本費(fèi)用,通常采用小規(guī)格池塘養(yǎng)殖親本進(jìn)行育苗,經(jīng)過多代人工繁育和養(yǎng)殖,致使河蟹養(yǎng)殖群體的種質(zhì)退化,養(yǎng)殖性能下降(Suiet al,2011; 王武等,2013)。因此,系統(tǒng)研究我國(guó)現(xiàn)有主要野生和養(yǎng)殖群體河蟹的遺傳多樣性、遺傳分化和種群結(jié)構(gòu)等,對(duì)其種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義(朱清順等,2008; 張世勇等,2013)。

近 10年來,由于河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加和主要水系禁漁期的執(zhí)行,使得野生河蟹的捕撈強(qiáng)度有所降低,加上各水系開展河蟹增殖放流和水域生態(tài)環(huán)境保護(hù)等,長(zhǎng)江、黃河和遼河等水系河蟹野生資源在一定程度上得以恢復(fù)(周剛等,2003; 施德龍,2006; 劉凱等,2013),這為各水系野生河蟹的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和優(yōu)異種質(zhì)發(fā)掘利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。先前有研究報(bào)道了長(zhǎng)江和遼河水系野生河蟹的遺傳特性和種群結(jié)構(gòu)等(李思發(fā)等,1999; 李海燕等,2003; Suiet al,2009;龔疏影等,2009),但是這些研究樣品多采集于 2000年前后,無法準(zhǔn)確反應(yīng)當(dāng)前各水系河蟹的種質(zhì)資源的現(xiàn)狀。另外,近 10多年來各水系野生河蟹均經(jīng)歷了野生群體數(shù)量下降、水系間盲目引種、養(yǎng)殖群體逃逸和增殖放流等人工干擾,這可能會(huì)對(duì)三水系河蟹野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)造成一定的影響,因此需要對(duì)現(xiàn)存三水系野生群體的遺傳特性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估。先前有關(guān)河蟹遺傳特征的研究報(bào)道主要是針對(duì)各水系野生群體(Herborget al,2007; Changet al,2008; Suiet al,2009),尚缺乏對(duì)我國(guó)三個(gè)主產(chǎn)水系現(xiàn)存野生和養(yǎng)殖群體遺傳特性的比較研究,這非常不利于我國(guó)河蟹種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用工作。

DNA微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeat,SSR)多態(tài)性來源于其核心序列重復(fù)次數(shù)的變化,具有信息含量豐富、多態(tài)性高、個(gè)體特異性強(qiáng)、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn),比RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記更能揭示動(dòng)物的遺傳特性,因此在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用(Baker,1994; Bentzenet al,2001)。目前,SSR已經(jīng)被應(yīng)用于河蟹的種群遺傳和遺傳育種中(Herborget al,2007; Changet al,2008; Suiet al,2009; 李曉暉等,2010),但是以往研究采用的SSR標(biāo)記數(shù)量較少,且沒有同時(shí)對(duì)我國(guó)現(xiàn)有主要野生和養(yǎng)殖群體河蟹的遺傳特征進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。鑒于此,本研究篩選了29對(duì)多態(tài)性較高的SSR標(biāo)記,比較了長(zhǎng)江、黃河和遼河水系野生及養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性、遺傳分化、瓶頸效應(yīng)和遺傳結(jié)構(gòu),以評(píng)估我國(guó)主要水系河蟹野生和養(yǎng)殖和群體的遺傳特性,為進(jìn)一步開展河蟹野生種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)異種質(zhì)挖掘利用和遺傳育種等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

長(zhǎng)江野生群體(YW)、黃河野生群體(HW)和遼河野生群體(LW)河蟹分別于2013年10—12月份采集于上海崇明縣(121.18°E,31.76°N),山東東營(yíng)市利津縣(118.52°E,37.61°N),遼寧盤錦市大洼縣(122.70°E,40.70°N); 長(zhǎng)江養(yǎng)殖群體(YP)、黃河養(yǎng)殖群體(HP)和遼河養(yǎng)殖群體(LP)河蟹分別采集于上海市崇明縣(121.26°E,31.74°N),山東東營(yíng)市墾利縣(118.74°E,37.59°N),遼寧盤錦市大洼縣(122.08°E,41.01°N)的河蟹養(yǎng)殖場(chǎng)(圖1)。每個(gè)群體分別隨機(jī)采集60只成蟹,體重為96—208g。分別取其附肢肌肉,用95%乙醇固定后在–20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 河蟹6群體的采樣地點(diǎn)Fig.1 Sampling location of six populations of E. sinensis

1.2 DNA提取

采用改進(jìn)的酚-氯仿法提取河蟹基因組 DNA(劉皓等,2015),采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性,采用微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào): Q5000,美國(guó)Quawell公司生產(chǎn))檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度,ddH2O稀釋至50ng/μL待PCR用。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

從已報(bào)道的河蟹 SSR引物中選擇 29對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增效果好的引物用于本研究,其中Esin18,Esin36,Esin42,Esin55,Esin67,Esin87引物序列參考H?nfling 等(2003);HLJEsd02,HLJEsc11,HLJEsc20,HLJEsb25,HLJEsc34,HLJEsa42,HLJEsd52,HLJEsc56,HLJEsc65,HLJEsa67,HLJEsa69,HLJEsa76,HLJEsc86,HLJEsb88引物序列參考 Chang等(2006);JPX-3,JPX-10,JPX-13引物序列參考Cheng等(2010);Q67,Q703,Q726,Q732,Q840,Q934引物序列參考熊良偉(2014)。所有正向(5'端)引物采用熒光標(biāo)記(FAM 或HEX),反向(3'端)為普通引物。PCR反應(yīng)體系總體積為 10μL,包括 50ng DNA 模板、1μL10×PCR buffer、200μmol/L dNTP、各 0.5μmol/L正反向引物和 0.5U Taq聚合酶,然后用ddH2O補(bǔ)充至10μL,所需試劑均購(gòu)于 Takara公司)。采用降落式 PCR反應(yīng)程序進(jìn)行SSR標(biāo)記擴(kuò)增,以提高熒光引物的結(jié)合效率,減少雜帶(Suiet al,2009),具體PCR程序?yàn)? 94°C預(yù)變性3min; 93°C 變性 1min,(退火溫度+6°C)退火 30s,72°C延伸1min,2個(gè)循環(huán); 93°C變性1min,(退火溫度+4°C)退火30s,72°C延伸1min,2個(gè)循環(huán); 89°C變性1min,(退火溫度+2°C)退火 30s,72°C延伸 1min,5個(gè)循環(huán);89°C變性1min,(正常退火溫度)退火30s,72°C延伸1min,20—25個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物于–20°C 保存待用。

根據(jù)不同SSR位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度范圍的差別,挑選 2—3個(gè)不同熒光標(biāo)記且長(zhǎng)度相差較大的SSR位點(diǎn)PCR產(chǎn)物,將其混合后利用后全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行分析(型號(hào): ABI-3730XL,美國(guó)ABI公司),采用GeneMaper-3.5軟件掃描峰圖后讀取目的片段的長(zhǎng)度,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Microsoft excel中整理以備分析(馬雪霞等,2007; 劉皓等,2015)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各位點(diǎn)基因片段的長(zhǎng)度和,確定每個(gè)樣品各SSR位點(diǎn)的基因型。利用 POPGEN 3.2軟件計(jì)算各位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、固定指數(shù)(FIS)(Nei,1978); 采用 PIC_CALC 0.6軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)(王婷等,2014),按照參考文獻(xiàn)Botstein等(1980)的標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)某位點(diǎn)PIC＞0.5時(shí),該位點(diǎn)為高多態(tài)性位點(diǎn); 利用 ARLEQUIN 3.5軟件的馬爾科夫鏈(MarkovChain)方法對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(Exoffieret al,2010)。

利用POPGEN 32軟件計(jì)算群體間的 Nei’s遺傳距離(Nei,1978),基于此距離采用MEGA 5.0軟件作UPGMA系統(tǒng)樹(Tamuraet al,2011); 用 ARLEQUIN 3.5軟件計(jì)算群體遺傳分化的 F-統(tǒng)計(jì)量(F-statistics,FST),FST＜0.05 為輕微分化(Ballouxet al,2002)。分子方差分析(AMOVA)分析變異來源(Exoffieret al,2010)。

基于無限等位基因模型(Infinite Allele Model,IAM)、雙相突變模型(Two-phased Model of Mutation,TPM)及逐步突變模型(Step-wise Mutation Model,SMM),用BOTTLENECK 3.4軟件進(jìn)行瓶頸效應(yīng)分析,采用符號(hào)檢驗(yàn)(Sign Test)和 Wilcoxon符號(hào)秩序測(cè)試(Wilcoxon Sign-rank Test)來確定雜合度過剩是否顯著(Maruyamaet al,1985); 采用STRUCTURE 2.3軟件對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,分析最佳K值,以確定群體遺傳結(jié)構(gòu)的理論群體數(shù)(Pritchardet al,2000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性及群體的遺傳多樣性

本研究選用了 29個(gè)河蟹微衛(wèi)星位點(diǎn),在 6個(gè)群體中均實(shí)現(xiàn)成功擴(kuò)增(表 1)。共檢測(cè)到 943個(gè)等位基因,各位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)介于 11—52之間(圖 2),平均為 32.52,有效等位基因數(shù)(Ne)在 1.844—31.269之間,平均為 15.637; 各位點(diǎn)觀測(cè)雜合度(Ho)在0.444—0.941之間,平均為 0.723,期望雜合度He介于 0.458—0.969,平均為 0.876; 平均多態(tài)信息含量PIC=0.864,除位點(diǎn) Esin87外,其余位點(diǎn)均為高多態(tài)性位點(diǎn)(PIC＞0.5); 平均香農(nóng)信息指數(shù)I=2.732; 位點(diǎn)Esin87、HLJEsa42、HLJEsc34、Q67、Q703處于Hardy-Weinberg平衡,其余位點(diǎn)均顯著或極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(P＜0.05)。

6個(gè)群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表2。整體上,6個(gè)群體的平均等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均觀測(cè)雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和平均香農(nóng)指數(shù)(I)接近,各群體的遺傳多樣性水平均較高。就近交系數(shù)(FIS)值而言,6個(gè)群體間存在一定的差異,其中遼河養(yǎng)殖群體最高,黃河養(yǎng)殖群體最低,大小順序依次為: 遼河養(yǎng)殖＞長(zhǎng)江野生＞遼河野生＞長(zhǎng)江養(yǎng)殖=黃河野生＞黃河養(yǎng)殖。就各位點(diǎn)群體內(nèi)FIS而言,除Esin67位點(diǎn)為負(fù)值(–0.016)外,其余均為正值。

2.2 群體的遺傳分化

6個(gè)群體的遺傳分化情況見表3。除長(zhǎng)江野生與黃河野生群體(FST=0.0040)、長(zhǎng)江野生與遼河養(yǎng)殖群體(FST=0.0 0 5 0)、黃河養(yǎng)殖與遼河養(yǎng)殖群體(FST=0.0034)的遺傳分化極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)外,其余群體之間的遺傳分化不顯著; 所有種群間的遺傳分化均屬輕微程度的分化(FST＜0.05)。Nei’s遺傳距離數(shù)據(jù)(Ds)與F-統(tǒng)計(jì)值(FST)的結(jié)果基本一致,長(zhǎng)江野生與遼河養(yǎng)殖群體遺傳距離最大(Ds=0.0989),其次為長(zhǎng)江野生與黃河野生(Ds=0.0968),長(zhǎng)江養(yǎng)殖與黃河野生群體的遺傳距離最小(Ds=0.0664)(表 3)。

表1 6個(gè)群體河蟹29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性Tab.1 Genetic polymorphism of the 29 microsatellite loci in six populations of E. sinensis

圖2 6個(gè)群體河蟹各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)量Fig.2 Number of Allele for the different SSR loci in the six populations of E. sinensis

表2 河蟹6個(gè)群體的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.2 Genetic diversity statistics of E. sinensis for the six populations

表3 Nei’s遺傳距離(Ds,對(duì)角線以下)及F-統(tǒng)計(jì)值(FST,對(duì)角線以上)Tab.3 Genetic distances (Ds,below diagonal) and genetic differentiation coefficient (FST,above diagonal) for the six populations of E. sinensis

基于Nei’s遺傳距離的UPGMA進(jìn)化樹結(jié)果顯示,長(zhǎng)江野生群體單獨(dú)聚為一支,其余5群體共同聚為大一支,其中長(zhǎng)江養(yǎng)殖群體、黃河野生群體與黃河養(yǎng)殖群體聚為一小支,遼河野生群體和養(yǎng)殖群體聚為另一小支,這兩小支共同形成一大支,它們與長(zhǎng)江野生群體并列。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示,14.02%的遺傳變異來自種群內(nèi)個(gè)體間,85.88%的變異來自個(gè)體內(nèi),來源于群體之間的差異僅占到0.10%(表4)。

2.3 瓶頸效應(yīng)分析

29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度(He)與在3個(gè)模型下的平均期望雜合度(Heq)見表5。在IAM模型下,除Esin87、Esin67之外,其它位點(diǎn)的He均大于Heq,有13個(gè)位點(diǎn)無顯著差異,其余位點(diǎn)均有顯著或極顯著差異; 在TPM模型下,8個(gè)位點(diǎn)的He小于Heq,其余位點(diǎn)He大于Heq,4個(gè)位點(diǎn)差異顯著(P＜0.05),其余位點(diǎn)無顯著差異; 在 SMM 模型下,位點(diǎn) 17個(gè)位點(diǎn)的He小于Heq,其余位點(diǎn)He大于Heq,共 5個(gè)位點(diǎn)差異顯著(P＜0.05),其中位點(diǎn)Esin87、Esin67在 TPM 和SMM模型下均差異極顯著(P＜0.01)。

表4 6個(gè)種群分子方差分析(AMOVA)Tab.4 AMOVA results for the six populations of E. sinensis

圖3 基于Nei’s遺傳距離的6個(gè)河蟹群體UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA clustering tree of E. sinensis based on Nei’ s genetic distance among populations

河蟹6群體突變-漂移平衡分析如表6所示。在符號(hào)檢驗(yàn)中,IAM模型下 6個(gè)群體均表現(xiàn)為雜合度過高,顯著或極顯著偏離突變-漂移平衡; TPM模型下幾個(gè)群體亦表現(xiàn)為雜合過度,但只有黃河野生和黃河養(yǎng)殖群體顯著偏離平衡(P＜0.05); 在 SSM 模型下,所有群體均表現(xiàn)出一定程度的雜合不足,除黃河養(yǎng)殖群體外,其余 5個(gè)群體顯著或極顯著偏離平衡。Wilcoxon符號(hào)秩序檢驗(yàn)中,IAM模型下所有群體均極顯著(P＜0.01)偏離突變-漂移平衡; TPM 模型下,長(zhǎng)江野生群體顯著偏離平衡(P＜0.05),黃河養(yǎng)殖群體極顯著偏離平衡(P＜0.01),其余各群體則處在突變-漂移平衡中; SMM 模型下,長(zhǎng)江野生和遼河養(yǎng)殖群體顯著偏離平衡(P＜0.05),遼河野生群體極顯著偏離平衡(P＜0.01),其余群體未偏離突變-漂變平衡。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究預(yù)熱次數(shù)設(shè)為10000,預(yù)設(shè)聚類數(shù)值(K值)為2—10個(gè),每個(gè)K值下重復(fù)運(yùn)算5次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)K值下差異不大,說明運(yùn)算長(zhǎng)度符合要求。根據(jù)K值對(duì)應(yīng)的相關(guān)參數(shù)的趨勢(shì),未發(fā)現(xiàn)明顯的折點(diǎn),未能成功劃分6群體河蟹的理論群體數(shù)。圖4為在K=2、3、4時(shí)的遺傳結(jié)構(gòu)圖,圖中各種顏色分布相互混亂,不能聚成相對(duì)獨(dú)立的群體,這暗示三水系6群體河蟹的遺傳組成混雜嚴(yán)重,遺傳分化不明顯。

表5 河蟹29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的瓶頸效應(yīng)分析Tab.5 Results of Botlleneck analysis of the 29 microsatellite loci in the 6 populations of E. sinensis

表6 河蟹6群體突變-漂移平衡分析Tab.6 Results of mutation-drift equilibrium tests of the 6 populations of E. sinensis

圖4 河蟹群體在不同假設(shè)K值下的遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig.4 STRUCTURE genetic cluster analysis for the six populations of E. sinensis

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

本研究篩選了中華絨螯蟹 29個(gè)的微衛(wèi)星位點(diǎn),在360只個(gè)體DNA樣本中進(jìn)行擴(kuò)增,并利用高分辨率的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行等位基因分型,從研究結(jié)果看,本研究中29個(gè)SSR位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)(Na=32.5170)和平均多態(tài)信息含量(PIC=0.864)多高于先前河蟹種群 SSR遺傳分析的研究報(bào)道(Changet al,2008; Suiet al,2009; 熊良偉等,2012;唐劉秀等,2013),除位點(diǎn)Esin87外,其余位點(diǎn)均為高多態(tài)性位點(diǎn)。本研究每個(gè)群體選擇樣本數(shù) 60個(gè),多于其上述研究樣本數(shù)量(28—40個(gè)),在一定范圍之內(nèi),樣本量的大小與所觀測(cè)到的不同基因座等位基因檢出數(shù)量之間存在正相關(guān)關(guān)系(高雅等,2008)。整體上,對(duì)相同群體和相同 SSR位點(diǎn)而言,本研究中等位基因數(shù)量、期望雜合度和觀測(cè)雜合度在大多數(shù)位點(diǎn)高于先前報(bào)道(H?nflinget al,2003; Changet al,2006; 唐劉秀等,2013),這可能與樣品數(shù)量和檢測(cè)技術(shù)不同有關(guān)。通常大樣本量和毛細(xì)管電泳分型技術(shù)能夠提供更可靠的遺傳多樣性信息(劉皓等,2015)。由此可見,本研究選用的 SSR位點(diǎn)、樣本量和毛細(xì)管電泳分型技術(shù),可以較全面地反映各水系河蟹的遺傳多樣性信息,能夠有效評(píng)估其群體遺傳特性。

本研究中 6個(gè)群體平均期望雜合度均較高(He=0.870—0.881),顯示本研究中野生和養(yǎng)殖河蟹群體均具有較高的遺傳多樣性水平,這與先前對(duì)我國(guó)幾個(gè)野生群體(Suiet al,2009)和養(yǎng)殖群體(朱澤遠(yuǎn)等,2007; 熊良偉等,2012)的研究結(jié)果相似。就野生群體而言,香農(nóng)信息指數(shù)反映的遺傳多樣性依次為: 長(zhǎng)江野生＞黃河野生＞遼河野生。遺傳多樣性水平由南向北依次降低,這種地理差異往往和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān),長(zhǎng)江水系流域面積廣,與干流相通的河道與湖泊多,適宜河蟹生長(zhǎng)和育肥,因而種群數(shù)量較大,相比之下,黃河及遼河水系由于所處緯度較高,水溫較低,流域面積相對(duì)較小,因此種群規(guī)模相對(duì)較小。3個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性依次為: 長(zhǎng)江養(yǎng)殖＞遼河養(yǎng)殖＞黃河養(yǎng)殖,本研究中長(zhǎng)江和遼河水系養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性情況與熊良偉等(2012)研究結(jié)果基本一致,黃河養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于長(zhǎng)江和遼河養(yǎng)殖群體,這可能是由于黃河流域河蟹養(yǎng)殖規(guī)模相對(duì)較小,其人工繁殖的基礎(chǔ)群體親本數(shù)量較少,經(jīng)過多代人工繁殖后導(dǎo)致其遺傳多樣性進(jìn)一步下降(熊良偉等,2012)。

從等位基因數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)看,本研究中長(zhǎng)江和黃河的養(yǎng)殖群體略低于相應(yīng)的野生群體,這與熊良偉等(2012)的研究結(jié)果相似,究其原因可能是兩個(gè)養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量較少造成的始祖效應(yīng)(founder effect),后續(xù)傳代育苗過程中主要通過表型選擇親本,容易增加近交幾率,類似的情況已經(jīng)在大西洋鮭(Salmon salar)中被證實(shí)(Skaalaet al,2004)。遼河養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)高于遼河野生群體,可能有兩方面的原因。其一,由于遼河水系面積相對(duì)較小,其野生河蟹群體數(shù)量遠(yuǎn)小于長(zhǎng)江水系和黃河水系,加之由于過渡捕撈、環(huán)境污染和洄游通道被水閘阻擋等原因,其野生群體經(jīng)歷過有效種群下降,導(dǎo)致其遺傳多樣性較低(王武等,2013);其二,由于長(zhǎng)江水系河蟹規(guī)格較大,長(zhǎng)江水系河蟹曾經(jīng)被引入遼河流域進(jìn)行池塘養(yǎng)殖,因此遼河水系養(yǎng)殖群體亦或曾受到長(zhǎng)江群體的影響,導(dǎo)致種質(zhì)混雜,其遺傳多樣性偏高(王武等,2007)。

3.2 群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究中 6個(gè)群體的河蟹種群的遺傳距離(DA)與地理距離呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,但并不完全吻合。如果沒有發(fā)現(xiàn)不同地理種群間的遺傳分化,基因流常被作為“默認(rèn)”的解釋(Suiet al,2009)。有研究者基于微衛(wèi)星標(biāo)記的瓶頸效應(yīng)和基因流動(dòng)分析研究歐亞多刺水蚤(Bythotrephes longimanus)入侵的報(bào)道提出,迅速蔓延的多產(chǎn)物種有可能獲得來自多個(gè)種群的基因流,而導(dǎo)致其群體遺傳分化較低(Colauttiet al,2005)。本研究天然地理種群結(jié)合地理相關(guān)養(yǎng)殖群體,能對(duì)地理種群間天然的基因流和因養(yǎng)殖活動(dòng)中跨區(qū)域引種和養(yǎng)殖群體逃逸產(chǎn)生的基因流動(dòng)作出側(cè)面的反映。從基于遺傳距離的聚類分析結(jié)果來看,相對(duì)其它水系而言,遼河水系的野生與養(yǎng)殖群體組成了一個(gè)較為封閉的地理種群?jiǎn)挝?而長(zhǎng)江、黃河養(yǎng)殖及野生群體可能因跨地域相互引種而導(dǎo)致有一定程度的混雜。李曉暉等(2010)對(duì)河蟹長(zhǎng)江水系野生群體和幾個(gè)養(yǎng)殖群體進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)射陽(yáng)地區(qū)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性指數(shù)高于其它幾個(gè)群體,同樣認(rèn)為是不同水系河蟹種質(zhì)混雜的結(jié)果。

群體的遺傳分化值數(shù)(FST)能揭示種群間的遺傳分化程度,FST值在0—0.05之間,群體的遺傳分化較弱;FST值在 0.05—0.15之間時(shí),遺傳分化水平中等,FST值大于 0.15時(shí),遺傳分化較大(Ballouxet al,2002)。本研究的幾個(gè)群體間的FST值在 0.0008—0.0050之間,遠(yuǎn)小于 0.05,遺傳分化水平微弱,這與我國(guó)6個(gè)水系的11個(gè)野生群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性研究結(jié)果基本吻合(FST=0.0001—0.0400) (Suiet al,2009)。而在中國(guó)沿海 5個(gè)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)地理種群中FST值為 0.0548—0.1083(李曉萍,2010),日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的幾個(gè)中國(guó)地理種群中,該值達(dá)0.0542—0.1559 (Yanget al,2010),克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的長(zhǎng)江下游幾個(gè)地理種群中,該值亦高達(dá)0.0405—0.1559 (王長(zhǎng)忠等,2009),日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicas)野生和人工養(yǎng)殖種群的FST值略低為0.023(Luanet al,2006),這幾種重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物地理種群的遺傳分化均高于河蟹。Brown等(1989)認(rèn)為異交物種 90%以上的遺傳變異來自群體內(nèi)部,本研究中分子方差分析結(jié)果顯示,群體之間的變異僅占變異總數(shù)的 0.10%,部分變異來源于群體內(nèi)個(gè)體間(14.02%),絕大部分變異來自個(gè)體內(nèi)部(85.88%),表明河蟹群體變異程度較低。與其它甲殼動(dòng)物相比,河蟹具有復(fù)雜的生活史和開放的生命周期,長(zhǎng)距離江海洄游習(xí)性使其面臨多種差異較大的生境。由此,與其它甲殼動(dòng)物相比,推測(cè)河蟹更容易因某些等位基因的丟失造成生命周期中某個(gè)環(huán)節(jié)的環(huán)境適應(yīng)能力減弱或喪失,進(jìn)而導(dǎo)致變異個(gè)體死亡或不能成功繁殖,而表現(xiàn)出較強(qiáng)的遺傳保守性。

3.3 群體動(dòng)態(tài)分析

6個(gè)種群的瓶頸分析結(jié)果中,在 3種模型下,均有部分位點(diǎn)呈現(xiàn)出He與Heq的顯著或極顯著差異,在符號(hào)檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩序檢驗(yàn)中,IAM模型下,顯示幾個(gè)群體近期經(jīng)歷了不同程度的瓶頸效應(yīng),SMM 模型下,除了黃河養(yǎng)殖群體外,其余 5個(gè)群體均存在瓶頸效應(yīng)。朱澤遠(yuǎn)等(2007)在研究中發(fā)現(xiàn)幾個(gè)河蟹養(yǎng)殖群體均存在瓶頸效應(yīng),王中清等(2013)在2004、2006、2007和2011年長(zhǎng)江野生群體中亦發(fā)現(xiàn)瓶頸效應(yīng),結(jié)合上述研究,表明中國(guó)大陸河蟹種群正面臨著持續(xù)的種質(zhì)衰退。遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,本研究的河蟹野生群體和養(yǎng)殖群體基因混雜現(xiàn)象嚴(yán)重,這一結(jié)果與徐燦(2007)的觀點(diǎn)相符,其研究認(rèn)為自1982年起,中國(guó)大陸多個(gè)水系的河蟹便開始通過養(yǎng)殖活動(dòng)中的無序引種和增殖放流交互混雜。

本研究中29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,有24個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡,觀測(cè)雜合度小于期望雜合度。Hardy-Weinberg平衡的偏離可能由多種原因?qū)е?如非隨機(jī)交配、選擇、突變、無效等位基因等,這樣就會(huì)造成群體內(nèi)存在的等位基因的丟失,純合子增加,種群的遺傳多樣性降低,從而增加近交衰退的幾率(楊銳等,2000)。當(dāng)群體內(nèi)觀測(cè)雜合度小于期望雜合度,同時(shí)FIS為正值,則表示群體內(nèi)近交程度較為嚴(yán)重(Frankham,2010),本研究的28個(gè)位點(diǎn)的FIS均為正值,說明三水系的河蟹野生和養(yǎng)殖群體內(nèi)近交程度嚴(yán)重,存在種質(zhì)衰退的風(fēng)險(xiǎn)。先前研究表明,長(zhǎng)江野生扣蟹的養(yǎng)殖性能優(yōu)于多年家養(yǎng)的池塘群體(Heet al,2014),這也暗示了長(zhǎng)江水系養(yǎng)殖群體種質(zhì)退化嚴(yán)重,遺傳多樣性較低。

綜上,6個(gè)種群遺傳多樣性較高,但存在明顯的種質(zhì)混雜和群內(nèi)近交,加之瓶頸效應(yīng)的造成的影響,這可能使其優(yōu)異種質(zhì)退化,不利于河蟹種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用,因此需要制訂科學(xué)的野生種質(zhì)保護(hù)方案和良種選育策略。對(duì)河蟹野生群體進(jìn)行保護(hù),在進(jìn)行水利工程時(shí)應(yīng)充分考慮對(duì)河蟹洄游的影響,天然水域增殖放流應(yīng)保證苗種來源于相應(yīng)的水系,從而避免種質(zhì)混雜。對(duì)河蟹進(jìn)行良種選育,應(yīng)盡量擴(kuò)大有效有效群體數(shù)量,降低近交衰退幾率,進(jìn)一步采取家系選育技術(shù),篩選與表型相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行多性狀復(fù)合育種提高選育效率。本研究為河蟹種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、良種選育和分子標(biāo)記開發(fā)提供了重要的基礎(chǔ)資料。

致謝上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院邱高峰教授提供部分微衛(wèi)星引物,傅建軍博士后在數(shù)據(jù)分析和論文寫作過程給予熱情指導(dǎo),謹(jǐn)致謝忱。

馬雪霞,王 凱,郭旺珍等,2007. 棉花SSR多重PCR技術(shù)的初步研究和利用. 分子植物育種,5(5): 648—654

王 武,王成輝,馬旭洲,2013. 河蟹生態(tài)養(yǎng)殖. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,59—84

王 武,成永旭,李應(yīng)森等,2007. 河蟹的生物學(xué). 水產(chǎn)科技情報(bào),35(1): 25—84

王 婷,黃智慧,馬愛軍等,2014. 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP標(biāo)記開發(fā)及多態(tài)性分析. 海洋與湖沼,45(6): 1300—1307

王中清,黃 姝,茅海成等,2013. 中華絨螯蟹奇、偶年天然群體的遺傳差異分析. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),22(5): 657—664

王長(zhǎng)忠,李 忠,梁宏偉等,2009. 長(zhǎng)江下游地區(qū) 4個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性分析. 生物多樣性,17(5):518—523

朱澤遠(yuǎn),王亞菊,施用暉等,2007. 熒光標(biāo)記微衛(wèi)星分析人工飼養(yǎng)中華絨螯蟹的遺傳多樣性. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào),37(4):591—596

朱清順,夏愛軍,潘建林等,2008. “蘇蟹一號(hào)” F3代選育群體生物學(xué)特性分析. 水產(chǎn)養(yǎng)殖,29(6): 8—12

劉 凱,湯 滔,段金榮等,2013. 長(zhǎng)江口九段沙水域中華絨螯蟹汛期特征及影響因子. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),20(3):614—623

劉 皓,劉 青,吳旭干等,2015. 中華絨螯蟹兩種微衛(wèi)星DNA分型方法的應(yīng)用比較. 生物學(xué)雜志,32(1): 90—94

許加武,任明榮,李思發(fā)等,1997. 長(zhǎng)江、遼河、甌江中華絨螯蟹種群的形態(tài)判別. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),21(3): 269—274

李 勇,李思發(fā),王成輝等,2001. 三水系中華絨螯蟹幼蟹形態(tài)判別程序的建立和使用. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),25(2): 120—126

李思發(fā),鄒曙明,1999. 中國(guó)大陸沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體親緣關(guān)系: RAPD指紋標(biāo)記. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),23(4): 325—330

李曉暉,許志強(qiáng),潘建林等,2010.中華絨螯蟹人工選育群體的遺傳多樣性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),17(2): 236—242

李曉萍,2010. 三疣梭子蟹微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建及五個(gè)野生地理群的多樣性分析. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文

李海燕,侯 林,魏鳳艷,2003. 中華絨螯蟹遼河種群野生、養(yǎng)殖及“性早熟”個(gè)體RAPD分析. 水產(chǎn)科學(xué),22(3): 1—3

李晨虹,李思發(fā),邢益于等,2002. 池養(yǎng)長(zhǎng)江蟹、遼河蟹生長(zhǎng)性能及其遺傳-環(huán)境交互作用分析. 水生生物學(xué)報(bào),26(4):335—341

楊 銳,喻子牛,陳再忠等,2000. 山東沿海褶牡蠣與太平洋牡蠣等位基因酶的遺傳變異. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),24(2): 130—133

張世勇,傅洪拓,喬 慧等,2013. 中華絨螯蟹遺傳育種研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),29(20): 39—45

周 剛,朱清順,胡本龍,2003. 不同水系中華絨螯蟹生長(zhǎng)比較的初步研究. 水產(chǎn)養(yǎng)殖,24(6): 34—37

趙 娜,2014. 盤山縣稻蟹生態(tài)種養(yǎng)模式的研究. 延吉: 延邊大學(xué)碩士學(xué)位論文

施德龍,2006. 關(guān)于對(duì) 2006年長(zhǎng)江口蟹苗汛的預(yù)測(cè)及對(duì)長(zhǎng)江口蟹苗的捕撈、運(yùn)輸、放養(yǎng)方法介紹. 漁業(yè)致富指南,(8):10—11

徐 燦,2007. 不同水系河蟹種質(zhì)混雜的初步研究. 上海: 上海水產(chǎn)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2—4

高 雅,李生斌,2008. STR遺傳多態(tài)性研究中樣本數(shù)量對(duì)等位基因檢出數(shù)量的影響. 遺傳,30(3): 313—320

唐劉秀,許志強(qiáng),葛家春等,2013. 中華絨螯蟹 3個(gè)育種基礎(chǔ)群體遺傳特征的微衛(wèi)星分析. 南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),36(2): 84—90

龔疏影,王 茜,湯華鑫等,2009. 長(zhǎng)江、遼河野生與天津養(yǎng)殖中華絨螯蟹同工酶的比較. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),29(1): 51—54

崔江華,2010. 黃河口中華絨螯蟹養(yǎng)殖技術(shù)研究與應(yīng)用. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文

熊良偉,2014. 中華絨螯蟹遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及經(jīng)濟(jì)相關(guān)性狀QTL定位. 上海: 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文,64—67

熊良偉,李 真,馬克異等,2012. 利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記分析中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體遺傳分化. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),20(12): 1441—1448

Baker J S F,1994. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds. In: Proceedings of the 5thWorld Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Guelph and Ontario,Canada,501—508

Balloux F,Lugon-Moulin N,2002. The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Mol Ecol,11(2):155—165

Bentzen P,Olsen J B,McLean J Eet al,2001. Kinship analysis of Pacific salmon: Insights into mating,homing,and timing of reproduction. Journal of Heredity,92(2): 127—136

Botstein D,White R L,Skolnick Met al,1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet,32(3): 314—331

Brown A H D,Clegg M T,Kahler A Let al,1989. Plant population genetics,breeding,and genetic resources.Sunderland Massachusetts Sinauer Associates,43—63

Chang Y M,Liang L Q,Li S Wet al,2006. A set of new microsatellite loci isolated from Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis. Mol Ecol Notes,6(4): 1237—1239

Chang Y M,Liang L Q,Ma H Tet al,2008. Microsatellite analysis of genetic diversity and population structure of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). J Genet Genomics,35(3): 171—176

Cheng Q X,Yuan C H,Wang Jet al,2010. Development of 20 microsatellite loci in the Japanese mitten crabEriocheir japonicaand cross-amplification in the Chinese mitten crabEriocheir sinensis. Conserv Genet Resour,2(1): 47—50

Cheng Y X,Wu X G,Yang X Zet al,2008. Current trends in hatchery techniques and stock enhancement for Chinese mitten crab,Eriocheir japonica sinensis. Rev Fish Sci,16(1—3): 377—384

Colautti R I,Manca M,Viljanen Met al,2005. Invasion genetics of the Eurasian spiny waterflea: evidence for bottlenecks and gene flow using microsatellites. Mol Ecol,14(7):1869—1879

Exoffier L,Lischer H E L,2010. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Mol Ecol Resour,10(3):564—567

Frankham R,Ballou J D,Briscoe D A,2010. Introduction to Conservation Genetics. Cambridge: Cambridge University Press,260—308

H?nfling B,Weetman D,2003. Characterization of microsatellite

loci for the Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis. Mol Ecol Notes,3(1): 15—17

He J,Wu X G,Li J Yet al,2014. Comparison of the culture performance and profitability of wild-caught and captive pond-reared Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)juveniles reared in grow-out ponds: Implications for seed selection and genetic selection programs. Aquaculture,434:48—56

Herborg L,Weetman D,Van Oosterhout Cet al,2007. Genetic population structure and contemporary dispersal patterns of a recent European invader,the Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis. Molecular Ecology,16(2): 231—242

Luan S,Kong J,Wang Q Y,2006. Genetic variation of wild and cultured populations of the Kuruma prawnMarsupenaeus japonicus(Bate 1888) using microsatellites. Aquac Res,37(8): 785—792

Maruyama T,Fuerst P A,1985. Population bottlenecks and nonequilibrium models in population genetics. II. Number of alleles in a small population that was formed by a recent bottleneck. Genetics,111(3): 675—689

Nei M,1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics,89(3):583—590

Pritchard J K,Stephens M,Donnelly P,2000. Inference of population structure using multilocus genotype data.Genetics,155(2): 945—959

Skaala ?,H?yheim B,Glover Ket al,2004. Microsatellite analysis in domesticated and wild Atlantic salmon (Salmo salarL.): allelic diversity and identification of individuals.Aquaculture,240(1—4): 131—143

Sui L Y,Wille M,Cheng Y Xet al,2011. Larviculture tecniques of Chinese mitten crabEriocheir sinensis. Aquaculture,315:16—19

Sui L Y,Zhang F M,Wang X Met al,2009. Genetic diversity and population structure of the Chinese mitten crabEriocheir sinensisin its native range. Marine Biology,156(8): 1573—1583

Tamura K,Peterson D,Peterson Net al,2011. MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol,28(10): 2731—2739

Xiong L W,Wang Q,Qiu G F,2012. Large-Scale isolation of microsatellites from Chinese mitten crabEriocheir sinensisvia a solexa genomic survey. Int J Mol Sci,13(12):16333—16345

Yang P,Chen L Q,Wang Wet al,2010. Genetic diversity of oriental river prawn (Macrobrachium nipponenseDe Haan)revealed by ISSR markers. Journal of Fishery Sciences of China,17(5): 913—921