菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)對(duì)重金屬Hg2+的富集及相關(guān)生物標(biāo)記物的識(shí)別*

陳曉聰 張 冉 李成華① 包永波

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波315100)

近年來(lái),隨著工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展,海洋環(huán)境質(zhì)量惡化的總趨勢(shì)依然嚴(yán)峻。重金屬污染物污染以其快速擴(kuò)散和蔓延能力、難以降解的特性以及通過(guò)食物鏈富集和放大的效應(yīng)而逐漸成為全球性的環(huán)境污染研究熱點(diǎn)(Jianget al,2006)。汞(Hg)作為環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一,在我國(guó)近海海域廣泛存在,部分海區(qū)汞濃度已高達(dá) 100 μg/L,是Ⅰ類海水 2000倍,汞污染對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類健康威脅嚴(yán)重(Liuet al,2011)。

研究發(fā)現(xiàn),海洋中的汞可通過(guò)食物鏈經(jīng)由海洋生物進(jìn)入人體,產(chǎn)生慢性汞中毒,嚴(yán)重者可出現(xiàn)神經(jīng)紊亂、癡呆等(王冬梅等,2001)。因此開(kāi)發(fā)效應(yīng)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的生物標(biāo)記物是實(shí)現(xiàn)海洋汞污染快速檢測(cè)的前提。海洋雙殼貝類營(yíng)埋棲生活、通過(guò)濾食攝食、代謝率低,對(duì)海洋污染物具有很強(qiáng)的生物富集作用,是理想的海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)指示生物(Moragaet al,2002; Iratoet al,2003)。菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)以其地理分布廣、是沿海海區(qū)的優(yōu)勢(shì)種、生物體能累積污染物、能對(duì)多種環(huán)境污染物產(chǎn)生響應(yīng)等特點(diǎn)被人們廣泛的應(yīng)用于污染物檢測(cè)和預(yù)警研究中。蛤仔擁有開(kāi)放式的循環(huán)系統(tǒng),當(dāng)受到環(huán)境脅迫時(shí),血淋巴細(xì)胞參與細(xì)胞免疫發(fā)揮防御作用。鰓作為蛤仔的呼吸器官,直接與環(huán)境污染物接觸。實(shí)驗(yàn)選取的鰓和血細(xì)胞是研究環(huán)境毒理的理想組織(Zanetteet al,2008; Boukiet al,2013)。

本文根據(jù)目前我國(guó)近海重金屬汞污染現(xiàn)狀,選取近海養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)貝類菲律賓蛤仔為研究對(duì)象,采用微波消解-原子熒光技術(shù)測(cè)定了鰓組織中重金屬汞的短期的富集效應(yīng),并借助定量 PCR分析相關(guān)基因包括抗氧化酶CAT、GST、GPx,藥物/毒物代謝酶CYP414A1,抗氧化蛋白分子Trx、MT、HSP70以及Lysozyme在汞脅迫下的表達(dá)模式,探索菲律賓蛤仔應(yīng)對(duì)污染物的解毒機(jī)制,篩選應(yīng)用于海洋環(huán)境汞污染的生物標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成體蛤仔[殼長(zhǎng)(3.5±0.14) cm,殼寬(2.0±0.22) cm]采集于浙江省寧波市某養(yǎng)殖廠,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前于溫度為(20±1)°C、鹽度為 22的海水。實(shí)驗(yàn)中所用到的海水均采集于遠(yuǎn)離工業(yè)和生活區(qū)的近海海域,屬于Ⅰ類海水,Hg濃度均低于檢出限。充氣暫養(yǎng)5天,定時(shí)換水,保持良好水質(zhì)。

1.1.2 藥品 氯化汞、硼氫化鉀、氫氧化鉀均為分析純,硫酸、鹽酸、高錳酸鉀均為優(yōu)級(jí)純,高純氬氣,測(cè)定用水為Miili Q水,汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為100 μg/L(由寧波市海洋與漁業(yè)研究院提供); RNAiso plus,SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRaⅡ

公司); MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit (生工公司); 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 儀器 AFS-230E雙道原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器),MARS6微波消解儀(美國(guó) CEM),超純水系統(tǒng)(德國(guó)Millipore),Rotor-Gene 6000實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(德國(guó)QIAGEN)。

1.2 方法

1.2.1 汞脅迫實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定量的 HgCl2粉末配制成濃度為1 g/L的Hg2+母液,保存?zhèn)溆?。量取適當(dāng)體積的母液,制備濃度為2.5、5、7.5和10 μg/L四個(gè)暴露劑量(不包括水體 Hg2+本底值)。實(shí)驗(yàn)水體30 L,每箱60只蛤仔,分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的0 h、24 h和48 h進(jìn)行取樣,每箱取10只個(gè)體解剖后取鰓和血細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組樣品設(shè)置3個(gè)平行樣本,所有樣品均于超低溫冰箱中保存。

1.2.2 原子熒光法測(cè)定汞含量 按照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378.6-2007)中原子熒光光譜法測(cè)定總汞方法進(jìn)行。將1 g鰓組織待測(cè)樣品轉(zhuǎn)入消解罐內(nèi),加入4 mL濃硝酸先于電熱板上消解30 min。待反應(yīng)趨于平穩(wěn)后,冷卻使氣體逸出。然后放入微波消解儀腔體內(nèi)消解 30 min。完畢后,冷卻至室溫,用 MilliQ水沖洗容器壁,將液體轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容后待測(cè)。配制標(biāo)準(zhǔn)系列(0,0.10,0.25,0.50,1.00 μg/L),用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制定。儀器的工作參數(shù)為光電倍增管負(fù)高壓: 280 V; 燈電流: 15 mA; 原子化器高度:8 mm; 載氣流量: 400 mL/min; 屏蔽氣流量:800 mL/min; 讀數(shù)時(shí)間: 10 s; 延遲時(shí)間: 1 s; 重復(fù)次數(shù): 1; 測(cè)量方法: Std. Curve; 讀數(shù)方式: Peak Area。用原子熒光光譜儀按上述給定條件進(jìn)行設(shè)定,預(yù)熱 30min,待儀器穩(wěn)定后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)定,并自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由已繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可讀出樣品溶液中汞元素的含量。當(dāng)汞含量為0.052×10–6mg/L時(shí),測(cè)定的再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8%; 平均相對(duì)誤差為 1%; 重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5%。本實(shí)驗(yàn)所用所有器皿,使用前均用15% 硝酸浸泡24 h,MilliQ水洗凈后使用。

1.2.3 菲律賓蛤仔解毒代謝基因 mRNA表達(dá)分析利用 Trizol方法獲得總 RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,取3 μg進(jìn)行cDNA合成,具體步驟參照上海生工生物工程有限公司 MMLV第一鏈 cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)(BS250)。用熒光定量 PCR檢測(cè)菲律賓蛤仔 CAT、GST、GPx、CYP414A1、Trx、MT、HSP70、Lysozyme基因的表達(dá)差異。采用β-actin作為內(nèi)參基因(Liet al,2011),實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表 1。PCR循環(huán)條件:94°C 預(yù)變性 5min、94°C 變性 15s、60°C 退火 15s、72°C 延伸 20s,共 40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,首先進(jìn)行溶解曲線分析,確認(rèn)反應(yīng)的特異性,再用Rotor-Gene的軟件進(jìn)行 CT值分析,采用 2-ΔΔCT法確定不同時(shí)段各個(gè)基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(Livaket al,2001)。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)給出。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件通過(guò)單因素方差分析(One-Way AVONA)和 Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行各濃度處理組與對(duì)照組差異的顯著性檢驗(yàn),P＜0.05表示有顯著性差異,P＜0.01表示有極顯著差異。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物信息表Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR used in the study

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔對(duì)汞的富集結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按實(shí)驗(yàn)方法利用汞的標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)得汞濃度(C)與其吸光值(If)呈良好的曲線關(guān)系,建立線性回歸方程為: If = 132.765C–2.137,該方程相關(guān)系數(shù)r2= 0.9993。

2.1.2 菲律賓蛤仔對(duì)汞的富集 菲律賓蛤仔鰓組織中 Hg2+的富集結(jié)果如圖1所示。不同暴露劑量下,所有檢測(cè)樣品均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增長(zhǎng)模式,在同一時(shí)間點(diǎn)的不同暴露劑量組,則表現(xiàn)為濃度依賴性的富集效應(yīng)。2.5 μg/L和7.5 μg/L 24 h處理組對(duì)Hg2+的富集與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05),在5 μg/L和10 μg/L處理24 h時(shí)與對(duì)照組呈極顯著差異(P＜0.01)。48 h處理組5、7.5、10 μg/L均與對(duì)照組呈現(xiàn)極顯著差異,并在 10 μg/L 組達(dá)到(0.308±0.037) μg/g 的最高富集量,為對(duì)照組的21倍(P＜0.01)。

圖1 汞脅迫菲律賓蛤仔鰓組織中Hg2+含量Fig.1 Hg2+ content in gill tissue of V. philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

2.2 重金屬汞脅迫后菲律賓蛤仔相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果

2.2.1 鰓 CYP414A1和 GPx基因表達(dá)結(jié)果 鰓CYP414A1和GPx基因表達(dá)結(jié)果如圖2所示。在24 h各處理組中鰓CYP414A1基因只在2.5 μg/L處理組表達(dá)顯著上調(diào),鰓GPx基因只在48 h 2.5 μg/L處理組表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05),2.5 μg/L處理組表達(dá)變化的結(jié)果與對(duì)照組和其它處理組均呈現(xiàn)顯著性差異。

2.2.2 鰓 Lysozyme和 HSP70基因表達(dá)結(jié)果 鰓Lysozyme和 HSP70基因表達(dá)結(jié)果如圖 3所示。鰓Lysozyme基因在24 h 7.5 μg/L處理組較其它處理組表達(dá)顯著上調(diào),上調(diào)倍數(shù)為 2.59,其它各組之間均無(wú)顯著差異。鰓HSP70基因只在48 h 7.5μg/L處理組中顯著下調(diào)(P＜0.05)。

2.2.3 鰓和血細(xì)胞 HSP70基因的表達(dá)結(jié)果 圖 4所示為汞脅迫24 h和48 h鰓和血細(xì)胞中HSP70基因的表達(dá)結(jié)果。血細(xì)胞中HSP70在24 h處理組中,僅在10 μg/L時(shí)表達(dá)顯著上調(diào),其它處理之間無(wú)顯著差異。鰓中HSP70則在脅迫到48 h時(shí),在10 μg/L組表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。

圖2 汞脅迫菲律賓蛤仔鰓中CYP414A1、GPx基因mRNA表達(dá)模式Fig.2 Expression profiles of CYP414A1,GPx in gill of V.philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

圖3 汞脅迫菲律賓蛤仔鰓中Lysozyme、HSP70基因mRNA表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of Lysozyme and HSP70 in gill of V.philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

圖4 汞脅迫菲律賓蛤仔鰓HSP70和血細(xì)胞HSP70基因mRNA表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of HSP70 in gill and hemocytes of V.philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

2.2.4 鰓 CAT、GST、Trx和 MT基因的表達(dá)結(jié)果圖5為Hg2+影響菲律賓蛤仔鰓中CAT、GST、Trx和MT基因表達(dá)的結(jié)果。由圖5可知: 菲律賓蛤仔鰓組織中的CAT和GST基因的表達(dá)模式均呈現(xiàn)“誘導(dǎo)—抑制”的趨勢(shì),與Hg2+濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。2.5 μg/L Hg2+處理組,CAT和GST基因表達(dá)極顯著上調(diào)(P＜0.01)。同時(shí),CAT在 48 h 7.5 μg/L組 2.36倍上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)。在 10 μg/L Hg2+處理組中,CAT 基因的表達(dá)量下降到與對(duì)照組相近水平,GST基因表達(dá)受到明顯抑制下調(diào)0.33倍(P＜0.01)。MT基因的表達(dá)模式呈現(xiàn)“倒拋物線”的趨勢(shì),且24 h處理組的表達(dá)量均高于48 h處理組。Trx基因在24 h的2.5和7.5 μg/L處理組中表達(dá)上調(diào),48 h的10 μg/L處理組中表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01),其它組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

2.2.5 血細(xì)胞 CAT、GST、CYP414A1、GPx、Trx、MT和 Lysozyme基因的表達(dá)結(jié)果 如圖 6所示,Hg2+脅迫菲律賓蛤仔血細(xì)胞中 7個(gè)基因的表達(dá)結(jié)果,其中 CYP414A1和 CAT基因在 48 h的 7.5μg/L和10 μg/L處理組織顯著上調(diào),其它濃度處理組的表達(dá)結(jié)果與對(duì)照組無(wú)顯著差異。GST和GPx在脅迫發(fā)生后表達(dá)顯著上調(diào),Lysozyme和MT基因表達(dá)在所有處理組中均顯著上調(diào),并且48 h的表達(dá)量均高于24 h(P＜0.01)。Trx基因與其它基因不同,呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),在5 μg/L 48 h處理組中表達(dá)量最低,是對(duì)照組的0.21倍(P＜0.01)。

圖5 汞脅迫菲律賓蛤仔鰓CAT、GST、MT和Trx基因mRNA表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of CAT,GST,MT and Trx in gill of V. philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

3 討論

本文以菲律賓蛤仔為對(duì)象檢測(cè)了重金屬汞的脅迫下鰓組織的富集效應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)鰓組織對(duì)汞的富集作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性,在10 μg/L劑量組處理48 h時(shí)達(dá)到(0.308±0.037) μg/g的最高富集量。這種富集作用主要通過(guò)呼吸作用將重金屬在鰓處滯留,再借助被動(dòng)吸收、胞飲或內(nèi)吞作用等方式向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),積累和放大(勵(lì)建榮等,2007)。研究發(fā)現(xiàn)不同水生動(dòng)物對(duì)重金屬的富集能力存在差異,其中貝類對(duì)重金屬的富集系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蝦類、魚(yú)類(阮金山等,2000)。貝類的不同組織和不同器官對(duì)重金屬的富集也有差異,崔可鐸等(1987)報(bào)道了 5種金屬在毛蚶(Scapharca subcrenata)體內(nèi)的積累情況為: 鰓＞外套膜＞閉殼肌＞內(nèi)臟＞肌肉。蔡立哲等(1999)指出Zn、Pb在菲律賓蛤仔兩種器官的濃集系數(shù)大小順序?yàn)? 鰓＞軟體部。苑旭洲等(2012)對(duì)菲律賓蛤仔全組織汞富集測(cè)定發(fā)現(xiàn)在1.0 μg/L的高濃度處理組菲律賓蛤仔體內(nèi)Hg的最大含量是0.027 μg/g。上述差異可能由于選擇的組織類型、暴露劑量和暴露時(shí)間的不同引起的,此外,重金屬的富集還受到生物個(gè)體大小、性別、年齡、繁殖狀態(tài)及水體鹽度、溫度、pH值等諸多因素的影響,致使同種種類生物的富集作用也有所差異(王召根等,2013)。

圖6 汞脅迫菲律賓蛤仔血細(xì)胞CYP414A1、CAT、GST、GPx、Lysozyme、MT和Trx基因mRNA表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of CYP414A1,CAT,GST,GPx,Lysozyme,MT and Trx in hemocytes of V. philippinarum after exposure to different doses of Hg2+

已有研究表明,重金屬在海洋生物體內(nèi)富集可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧自由基,如 H2O2、O2–、·OH等,破壞生物體內(nèi)的活性氧平衡,進(jìn)而引起生物體的氧化損傷(Regoliet al,2014)。機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)是保障重金屬污染脅迫造成的活性氧平衡的重要調(diào)節(jié)體系,因而常被作為監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染物的候選生物標(biāo)記物(Winstonet al,1991)。Regoli等(2014)指出海洋生物的氧化應(yīng)激通路中,過(guò)氧化氫酶(CAT)是防止ROS分子形成必不可少的分子。CAT的主要作用就是催化 H2O2分解為 H2O與O2,使得 H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的HO·。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)則利用 H2O2將還原型谷胱甘肽(GSH)氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG),使H2O2還原成無(wú)毒的羥基化合物,從而降低 H2O2濃度。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)作為第二階段解毒酶可催化污染物與 GSH 結(jié)合,生成極性小分子物質(zhì)從而減輕其毒性(閆博等,2007)。汞脅迫下蛤仔鰓組織中CAT、GPx和 GST基因均呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的表達(dá)模式,這種在低劑量表現(xiàn)為刺激效應(yīng),而高劑量則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)的模式稱為“毒物興奮效應(yīng)”(顧海龍等,2013)。而血細(xì)胞中CAT、GPx和GST基因則呈現(xiàn)上調(diào)的模式,這可能由于血細(xì)胞和鰓的生理功能不同而存在差異。有研究證實(shí)Cd脅迫下貽貝(Mytilus galloprovincialis)的 GST基因表達(dá)被上調(diào),野外站點(diǎn)采集的貽貝 GST基因表達(dá)的水平與實(shí)際環(huán)境中污染狀況間相關(guān)性良好(Hoarauet al,2006),Hg脅迫下蛤仔血細(xì)胞中 GST基因表達(dá)上調(diào)與上述結(jié)果一致。Zhang等(2012)利用RACE PCR技術(shù)克隆了菲律賓蛤仔中一種新型的細(xì)胞色素P450,命名為CYP414A1。并研究了在苯并[α]芘、鎘和銅脅迫下其 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,鎘脅迫條件下表達(dá)量明顯上調(diào),銅脅迫條件下表達(dá)量明顯下調(diào),為CYP414A1作為分子標(biāo)記物研究提供了基礎(chǔ)。汞脅迫下蛤仔血細(xì)胞和鰓中CYP414A1的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)與鎘脅迫結(jié)果一致。

除抗氧化酶外,金屬硫蛋白(MT)、硫氧還蛋白(Trx)和熱休克蛋白(HSP70)等參與生物體的重金屬解毒和自由基清除等修復(fù)作用的蛋白分子也廣泛用于生物標(biāo)記物的研究(Bierkenset al,1998; Cosson,2000;Jikimotoet al,2002)。在關(guān)于Cd和Cu脅迫菲律賓蛤仔的報(bào)道中指出,Trx在肝胰腺中均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)(Wanget al,2011),本研究中汞脅迫下鰓和血細(xì)胞中Trx的表達(dá)模式不相同,血細(xì)胞中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),鰓中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明Trx在不同組織中對(duì)不同重金屬的響應(yīng)存在差異?；舳Y輝等(2012)研究了在不同濃度重金屬Cd2+脅迫條件下,縊蟶內(nèi)臟團(tuán)中MT mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)具有明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng),呈現(xiàn)脈沖式波動(dòng)。汞脅迫下蛤仔鰓組織中MT的表達(dá)模式也呈現(xiàn)脈沖式波動(dòng),血細(xì)胞中MT的表達(dá)模式則呈現(xiàn)了良好的時(shí)間效應(yīng),并且所有處理組MT的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均顯著上調(diào)(P＜0.05)。說(shuō)明汞的脅迫使 MT大量表達(dá)參與解毒,MT mRNA表達(dá)變化可以作為指示環(huán)境重金屬污染的一個(gè)良好的生物參考指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體遇到重金屬脅迫等刺激時(shí),HSP70可通過(guò)防止蛋白的凝聚及變性,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,增強(qiáng)機(jī)體抗刺激及生存能力(Morimotoet al,1992)。本研究中鰓和血細(xì)胞中HSP70的表達(dá)量在高濃度處理組顯著上調(diào),說(shuō)明 HSP70表達(dá)量增加用來(lái)維護(hù)機(jī)體的正常生理活動(dòng)。溶酶體是累積重金屬的主要場(chǎng)所,過(guò)量的重金屬離子進(jìn)入生物體內(nèi)會(huì)改變?nèi)苊阁w膜的通透性,造成大量酶的釋放。溶菌酶(Lysozyme)是貝類中研究最多的溶酶體酶,它可以降解細(xì)胞外病原生物,起到機(jī)體免疫防御的功能。研究表明,重金屬能夠改變魚(yú)類溶菌酶活性(Wuet al,2007),而 di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP)的脅迫能夠引起菲律賓蛤仔溶菌酶基因表達(dá)量的變化(Luet al,2013)。因此,溶菌酶是一種對(duì)外源脅迫較為敏感的響應(yīng)成分。汞脅迫對(duì)金魚(yú)(Carassius auratus)胚胎發(fā)育的影響的研究中發(fā)現(xiàn),溶菌酶的活力被誘導(dǎo),并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴型(Konget al,2012 )。本研究中蛤仔血細(xì)胞中Lysozyme基因在所以處理組均表達(dá)上調(diào),對(duì)汞脅迫響應(yīng)靈敏,與上述觀點(diǎn)一致。

研究中各基因的表達(dá)變化則說(shuō)明蛤仔的抗氧化防御系統(tǒng)參與清除Hg2+的脅迫產(chǎn)生的氧化損傷。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為組合型的生物標(biāo)記物能更加準(zhǔn)確、全面的評(píng)價(jià)重金屬的毒性作用。本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下設(shè)置一系列 Hg2+處理濃度,利用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)檢測(cè)了菲律賓蛤仔鰓和血細(xì)胞中 8種不同功能基因的 mRNA表達(dá)變化,從中選擇可指示汞污染的基因作為潛在的生物標(biāo)記物。從篩選結(jié)果中看出,鰓CYP414A1和GPx基因、鰓Lysozyme和HSP70基因、鰓和血細(xì)胞HSP70基因,可分別指示2.5、7.5、10 μg/L不同濃度的汞污染,基本符合生物標(biāo)記物評(píng)價(jià)要求,并且上述基因可作為組合型的生物標(biāo)記物增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。鰓和血細(xì)胞中其它基因的表達(dá)結(jié)果可以看出各基因?qū){迫作出響應(yīng),但響應(yīng)結(jié)果不符合生物標(biāo)記物的篩選原則,不能作為指示汞污染的生物標(biāo)記物。

綜上所述,本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選了一批用于指示海洋汞污染的菲律賓蛤仔分子生物標(biāo)記物,明確了各生物標(biāo)記物基因表達(dá)模式,表明這些分子生物標(biāo)記物可作為組合型生物標(biāo)記物較有效地反映海洋環(huán)境汞污染狀況,與汞在蛤仔體內(nèi)富集的數(shù)據(jù)相結(jié)合,增加了一系列生物標(biāo)記物共同指示海洋環(huán)境中汞污染的可行性。

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