層層組裝法制備仿生exosomes的研究

常莎莎, 李可欣, 羅 月, 李文攀, 陳大為

(沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

層層組裝法制備仿生exosomes的研究

常莎莎, 李可欣, 羅 月, 李文攀, 陳大為*

(沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

目的優(yōu)化包載異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白(BSA-FITC)仿生exosomes 的處方工藝及制備。方法采用BSA-FITC作為模型蛋白，以包封率為考察指標，借助三因素三水平星點設(shè)計-效應面法對外層DOPE與內(nèi)層PC質(zhì)量比、組裝溫度、外層DOPE與DC-Chol質(zhì)量比進行優(yōu)化，篩選最佳處方，確定層層組裝法制備對蛋白質(zhì)多肽類藥物具有較高包封率的仿生exosomes，并對其制劑學性質(zhì)進行考察。結(jié)果優(yōu)化處方為：外層DOPE與內(nèi)層PC質(zhì)量比為2.20∶1，內(nèi)外層混合后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為58 ℃，外層DOPE與DC-Chol質(zhì)量比為4.28∶1，所制得仿生exosomes的平均粒徑(62.7±6.33) nm，多分散系數(shù)(P.I.)為0.286，包封率為(91.02±0.17)%。結(jié)論星點設(shè)計-效應面法所建立的模型預測性良好，成功實現(xiàn)了對仿生exosomes的處方優(yōu)化，層層組裝法成功制備了對蛋白質(zhì)多肽類藥物具有較高包封率且粒徑較小的仿生exosomes。

藥劑學；仿生exosomes；層層組裝法；異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白；星點設(shè)計

Exosomes起源于內(nèi)吞體系統(tǒng)，并被排出細胞外，是一類直徑為40～100 nm的由脂質(zhì)雙層膜包裹的球體結(jié)構(gòu)[1-2]，含有許多與來源細胞功能相關(guān)的蛋白質(zhì)或肽類[3]。由于其結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似，提示可以用藥劑學的理論和手段人工組建具有exosomes結(jié)構(gòu)性及功能性的納米仿生exosomes作為細胞間傳遞信息的新型載體[4]。

蛋白質(zhì)多肽類藥物因其具有良好的水溶性，通常采用逆向蒸發(fā)法制備，但在完成有機溶劑蒸發(fā)的過程中，容易造成藥物的泄露，使包封率降低。本實驗中，作者借助層層組裝的理念，選擇異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白(BSA-FITC)為模型蛋白，采用層層組裝法制備納米仿生exosomes，通過靈敏度較高的熒光檢測法測定包封率，并依靠三因素三水平的星點設(shè)計獲得了最優(yōu)處方，這為仿生exosomes的體外構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

SHZ-D循環(huán)水式真空泵、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪華儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠) ，JY92-2D超聲波細胞粉碎機( 寧波新芝科器研究所) ， WX80A渦旋混合器(上海精科實業(yè)有限公司)，F(xiàn)A1104電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)，Nicomp-380激光粒度測定儀(美國Particle Sizing Systems公司)， TECAN SPECTRA酶標儀(德國Wetzlar公司)。

注射用大豆磷脂(藥用，PC的質(zhì)量分數(shù)含量>95%，上海泰偉藥業(yè)有限公司)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)，O-[(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲?；鵠膽固醇鹽酸鹽(DC-Chol，愛必信生物科技有限公司) ，異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白(BSA-FITC，美國Sigma公司)，蓖麻油聚氧乙烯35醚(Cremophor EL，德國BASF公司)，瓊脂糖凝膠 4B(Sepharose 4B，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)，其他試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 層層組裝法制備仿生exosomes

仿生exosomes與納米脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)相似，但粒徑只有40～100 nm，因此，為了獲得小粒徑的制劑，本實驗將微乳理念引入到仿生exosomes的制備中，分別制備了內(nèi)層及外層脂質(zhì)層，并最終制得了仿生exosomes。

2.1.1 內(nèi)層脂質(zhì)層的制備

采用偽三元相圖優(yōu)化油相、水相及乳化劑的比例。以Cremophor EL和PC為混合乳化劑，按照Km(mCremophorEL∶mPC)為 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合均勻，乙醚為油相，在磁力攪拌下逐滴加入 BSA-FITC，觀察體系由濁至清現(xiàn)象，記錄臨界點時的各組分質(zhì)量分數(shù)。由圖1(A)可見，在Km=3∶7和4∶6附近可得微乳區(qū)。再分別以Km為3∶7和4∶6為1個頂點，乙醚和BSA-FITC為另外2個頂點，得到乳化劑-油相-水相的三元相圖（圖1B、C)，優(yōu)選Km為3∶7。結(jié)果表明，磷脂-蓖麻油聚氧乙烯35醚-乙醚-水所制成的油包水型微乳的最佳處方質(zhì)量比為4.2∶1.8∶6∶1。精密稱取PC 10.0 mg和Cremophor EL 4.28 mg，加入乙醚20.0 mL使之溶解，25 ℃于磁力攪拌下滴加BSA-FITC 2.3 mL，制備W/O型內(nèi)層。

Fig. 1 The pseudo-ternary phase diagram of Cremophor EL/PC/water phase (A), mCremophorEL∶mPC=4∶6(B) and mCremophorEL∶mPC=3∶7(C)圖1 EL-PC-水相(A)、mCremophorEL∶mPC=4∶6(B)和mCremophorEL∶mPC=3∶7 (C)的偽三元相圖

2.1.2 仿生exosomes的制備

精密稱取一定比例的DOPE與DC-Chol至50 mL圓底燒瓶中，加入乙醚5.0 mL使之溶解，5 ℃減壓成膜后，加入蒸餾水和乙醇體積比為2∶1的混合溶劑1.5 mL，于60 ℃水浴下水化，冰浴下200 W探頭超聲3 min，作為外層脂質(zhì)層[5-6]。將外層加入“2.1.1”條下內(nèi)層乙醚中，渦旋混合5 min后，一定溫度下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，冰浴下200 W探頭超聲3 min，制得包載BSA-FITC的仿生exosomes，4 ℃密封保存。

2.2 仿生exosomes包封率的測定

2.2.1 標準曲線的繪制

取適量BSA-FITC用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，并分別稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、50、125和250 mg·L-1的系列溶液。分別取上述溶液200 μL加至黑色96孔熒光板中，用酶標儀在激發(fā)波長491 nm、發(fā)射波長520 nm條件下測定熒光強度值，以熒光強度(AFI)對BSA-FITC溶液的質(zhì)量濃度(ρ)作圖并進行線性回歸，回歸方程為AFI=0.300 3ρ-3.64×10-2(r=0.999 5)，結(jié)果BSA-FITC質(zhì)量濃度在5～250 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 方法學考察

空白仿生exosomes回收率：精密量取空白仿生Exosomes 500 μL上樣于Sepharose 4B凝膠柱的頂端，收集洗脫液。分別取上述洗脫液200 μL加至黑色96孔熒光板中，用酶標儀在激發(fā)波長491 nm、發(fā)射波長520 nm條件下分別測定熒光強度值(Am)；精密量取空白仿生exosomes 500 μL，取空白仿生exosomes 200 μL加至黑色96孔熒光板中，采用相同方法測定熒光強度值（An），計算回收率（R）。結(jié)果顯示，該測定方法的回收率為98.89%～99.57%，相對標準偏差（RSD）<2%，符合方法學要求。回收率計算方程如下：R=（Am/An）×100%。

2.2.3 包封率的測定

采用凝膠過濾法[7-8]測定包載 BSA-FITC仿生 exosomes的包封率。由洗脫曲線圖 2可見，仿生exosomes與BSA-FITC可完全分離。經(jīng)方法學考察，精密度及回收率均符合要求。精密量取“2.1”條下仿生exosomes 500 μL，上樣于Sepharose 4B (20 cm× 2.5 cm)凝膠柱的頂端，以pH值7.4的磷酸鹽緩沖液為洗脫液，收集流出液。代入上述標準曲線分別計算游離 BSA-FITC的質(zhì)量(mf)和仿生exosomes包載BSA-FITC的質(zhì)量(me)，計算包封率。w(EE)=[me/(mf+ me)]×10。

Fig. 2 The elution curves of exosomes biomimetic and free BSA-FITC through Sepharose 4B圖 2 仿生exosomes和游離BSA-FITC通過Sepharose 4B分離的洗脫曲線

2.3 星點設(shè)計-效應面法優(yōu)化處方

2.3.1 試驗設(shè)計

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取對BSA-FITC仿生exosomes包封率影響較為顯著的3個因素，即：外層DOPE與內(nèi)層PC的質(zhì)量比(X1)、內(nèi)外層混合后的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度(X2)，外層DOPE與DC-Chol的質(zhì)量比(X3)，以包封率(Y1)為考察指標進行星點設(shè)計。各因素及水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2。

Table 1 Levels and factors used in Box-Behnken design表1 星點設(shè)計的因素和水平

Table 2 Experimental runs and results of responses for Box-Behnken design表2 星點設(shè)計-效應面法的實驗設(shè)計和結(jié)果

2.3.2 模型擬合及分析

用Design Expert8.0.6.1軟件對試驗結(jié)果進行模型擬合，結(jié)果表明用二次多項式擬合效果最佳，回歸方程如下：

Y1%=-1 419.629+64.663X1+49.711 6X2-22.499X3-0.343 5X1X2-1.722 5X1X3+1.453 5X2X3-8.158 25X12-0.464 73X22- 6.358 25X32(P=0.000 4, r=0.984 1)。

擬合方程的相關(guān)系數(shù)說明設(shè)計模型擬合程度良好，可以用此模型對BSA-FITC的處方進行分析和預測。從表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，模型中X3(P<0.000 1)、X22(P=0.000 2)極顯著，X1(P=0.007 5)、X2(P=0.006 7)、X2X3(P=0.004 0)、X12(P=0.001 9)、X32(P=0.006 9)顯著，其他項不顯著。

Table 3 Analysis of variance table表3 方差分析表

2.3.3 效應面分析

應用Design Expert8.0.6.1軟件繪制不同影響因素對于各指標的三維曲面圖，結(jié)果見圖3。根據(jù)軟件擬合BSA-FITC 仿生exosomes的最優(yōu)處方工藝為：外層DOPE與內(nèi)層PC的質(zhì)量比為 2.20∶1，內(nèi)外層混合后的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為58.12 ℃，外層DOPE與DC-Chol的質(zhì)量比為4.28∶1，軟件模型擬合計算出的包封率為91.20%。

Fig. 3 3D surface response diagrams for encapsulation efficiency among representative factors圖 3 各因素交互作用對包封率的3D效應面圖

2.4 優(yōu)化處方的驗證及性質(zhì)考察

2.4.1 優(yōu)化處方的驗證

按優(yōu)化處方制備3批仿生exosomes。精密稱取PC 10.0 mg和Cremophor EL 4.28 mg，加入乙醚20.0 mL使之溶解，于25 ℃磁力攪拌下滴加3 g·L-1BSA-FITC作為W/O型內(nèi)層。精密稱取DOPE 22.0 mg和DC-Chol 5.1 mg至50 mL圓底燒瓶中，加入乙醚5.0 mL使之溶解，25 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后，加入蒸餾水-乙醇（體積比2∶1）的混合溶劑1.5 mL，于60 ℃水浴下水化，冰浴下探頭超聲3 min(200 W)，作為外層。將外層加入內(nèi)層中，渦旋混合5 min，58 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除有機溶劑，冰浴下200 W探頭超聲3 min，制得包載BSA-FITC的納米仿生exosomes，平均包封率為(91.02±0.17)%，可見星點設(shè)計-效應面法預測性良好。

2.4.2 仿生exosomes的形態(tài)

取仿生exosomes適量，加水稀釋后滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)表面，以質(zhì)量分數(shù)2.0%的磷鎢酸負染，自然干燥后于透射電子顯微鏡下觀察仿生exosomes形態(tài)和大小。由圖 4可見，仿生exosomes具有明顯的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，并且大小均一、形態(tài)圓整。

Fig. 4 Transmission electron micrographs (TEM) of biomimetic exosomes圖 4 仿生exosomes透射電鏡圖

2.4.3 仿生exosomes的粒徑

采用 Nicomp-380激光粒度測定儀測定仿生 exosomes 粒徑大小及粒徑分布（圖 5）。結(jié)果BSA-FITC仿生 exosomes平均粒徑為(62.70±6.33) nm，多分散系數(shù)(P.I.)為 0.286，可見制備的仿生exosomes粒徑較小且分布均勻。

Fig. 5 Particle size distribution of biomimetic exosomes圖 5 仿生exosomes 的粒度分布圖

3 討論

a. Exosomes是一類直徑為40～100 nm的脂質(zhì)雙層球形囊泡，攜帶很多與來源細胞某些功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，來源于腫瘤細胞的exosomes含有豐富的腫瘤抗原，在腫瘤模型中可發(fā)揮有效的免疫刺激作用，因此，成為腫瘤免疫治療的新熱點。作者根據(jù)exosomes的結(jié)構(gòu)特點，采用層層組裝法制備仿生exosomes，不僅獲得了相似的大小，藥物的包封率也達到90%以上。首先，借助偽三元相圖，制得W/O型微乳作為內(nèi)層脂質(zhì)層，平均粒徑僅為(31.30±2.3) nm，藥物被包裹于微乳之中；然后，通過乙醇-水混合溶劑溶解DOPE脂質(zhì)膜形成外層脂質(zhì)層，DOPE分子呈錐狀，頭部體積較小，易于形成單層囊泡結(jié)構(gòu)[13]，在60 ℃水浴水化下，DOPE的脂質(zhì)流動性增強，DOPE分子為了降低體系的能量將相互聚集形成親水基向外、親油基向內(nèi)的單層囊泡，同時混合溶劑中乙醇的存在也可以阻止囊泡間的聚集，探頭超聲后，囊泡粒徑變小，外觀具有明顯的淡藍色乳光。當內(nèi)、外層混合后，由于微乳中油相乙醚體積較大，因此，微乳的結(jié)構(gòu)不會改變，被包裹的藥物仍然存在于微乳的乳滴內(nèi)，但對外層脂質(zhì)囊泡來說，溶劑性質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變，其結(jié)構(gòu)將發(fā)生第一次翻轉(zhuǎn)，形成親水基向內(nèi)、親油基向外的結(jié)構(gòu)，隨著溶劑乙醚的逐漸蒸發(fā)，體系的親水性增強，由于DOPE與PC相比，親水基的頭部體積更小，相變溫度更低，所以在58 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度下，DOPE脂質(zhì)膜的流動性迅速增強，隨即發(fā)生第二次翻轉(zhuǎn)，即DOPE的親油基將指向W/O型微乳的疏水端，而親水基指向外，形成具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的仿生exosomes，微乳中的蛋白藥物由于經(jīng)過層層包封，從而提高了藥物包封率。

b. Exosomes與脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)相比，粒徑更小，達到了40～100 nm之間，具有很強的在各細胞間攜帶及傳遞信息的能力，其次，功能性更強，本文中選擇的脂質(zhì)材料DOPE為exosomes中的主要脂質(zhì)成分，陽離子脂質(zhì)DC-Chol的加入也提高了其與免疫細胞的結(jié)合能力，此外，其較高的蛋白包封率本身就確保了高效的抗原遞送能力，這為后期腫瘤抗原的遞呈及免疫細胞的高效攝取提供了有力的保障。

c. 在仿生 exosomes的包封率測定方法中，嘗試過超速離心法、透析法和超濾法。但由于仿生exosomes平均粒徑低于100 nm，采用超速離心法，并不能將仿生exosomes和游離藥物完全分開；透析法依靠膜內(nèi)外濃度差分離，在濃度梯度下會導致藥物出現(xiàn)泄露，包封率偏低；超濾法因蛋白質(zhì)多肽類藥物特殊的空間結(jié)構(gòu)易被超濾膜吸附和沉積，所測包封率偏高。作者采用凝膠過濾法，分離仿生exosomes和游離藥物，通過測定熒光強度值測定包封率，該法不僅操作簡便、快捷，而且靈敏度高、分離效果好。

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Study on biomimetic exosomes prepared by layer-by-layer assemble methods

CHANG Sha-sha，LI Ke-xin，LUO Yue，LI Wen-pan，CHEN Da-wei*
（School of pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveTo optimize the formulation of BSA-FITC biomimetic exosomes. Methods Fluorescein isothiocyanate labeled bovine serum albumin was chosen as a model protein, then three factors which have major effect on encapsulation efficiency were selected to investigate, such as the ratio of outer-phase DOPE to the inner-phase PC, evaporation temperature of the mixer, and ratio of the outer-phase DOPE to DC-Chol. Box-Behnken design was applied to optimize the lipid formulation.Layer-by-layer assemble method was selected to prepare biomimetic exosomes of protein and peptide. Results The optimized experimental conditions were as follows: the mass ratio of outer-phase DOPE to the inner-phase PC was 2.20∶1; evaporation temperature of the mixer was 58 ℃ and the mass ratio of outer-phase DOPE-DC-Chol was 4.28∶1. Optimized biomimetic exosomes formulation displayed the mean particle size of (62.7±6.33) nm, the poly-dispersion index of 0.286, and encapsulation efficiency of (91.02±3.10)%. Conclusions Box-Behnken design was successfully used in the formulation optimization, and layer-by-layer assemble methods was suitable for prepare biomimetic exosomes of protein and peptide with higher encapsulation efficiency and smaller particle size.

pharmaceutics; biomimetic exosomes; layer-by-layer assemble methods; BSA-FITC; Box-Behnken design

R94

：A

(本篇責任編輯：趙桂芝)

(2015)04-0117-09

10.14146/j.cnki.cjp.2015.04.001

2014-01-08

國家自然科學基金資助項目（81302721）

常莎莎(1989-), 女(漢族), 安徽宿州人, 碩士研究生，E-mail shashashmily3@163.com; *

:陳大為(1959-) 男(漢族), 遼寧海城人, 教授, 博士, 主要從事藥物新劑型的研究, Tel. 024-23986308, E-mail chendawei@syphu.edu.cn。