七氟烷預處理對失血性休克豬血漿腸脂肪酸結(jié)合蛋白、D-乳酸濃度和細菌移位的影響

王麗晶，孫瑩杰，刁玉剛，張鐵錚，金 強

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·論著·

七氟烷預處理對失血性休克豬血漿腸脂肪酸結(jié)合蛋白、D-乳酸濃度和細菌移位的影響

王麗晶，孫瑩杰，刁玉剛，張鐵錚，金 強*

目的 探討七氟烷預處理對失血性休克豬血漿腸脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)、D-乳酸濃度和細菌移位的影響。方法 巴馬小型豬24頭，雌雄不拘，采用隨機數(shù)字表法均分為對照(C)組、失血性休克(S)組和七氟烷預處理(Sev)組。Sev組吸入七氟烷并保持2%呼出濃度30 min，C組和S組吸入空氣30 min。之后S組和Sev組制備失血性休克模型。分別于麻醉前(T0)、休克后30 min(T1)、1 h(T2)、1.5 h(T3)、2 h(T4)、3 h(T5)和4 h(T6)，應用ELISA法測定各組血漿D-乳酸和I-FABP含量。于T6時點取腸組織行HE染色，取下腔靜脈血、腸系膜淋巴結(jié)及肝、肺、腎、脾組織行細菌培養(yǎng)，并計算遠隔器官細菌移位率。結(jié)果 Sev組血漿D-乳酸、I-FABP濃度和遠隔器官細菌移位率均明顯低于S組(P<0.05)，明顯高于C組(P<0.05)。HE染色顯示，S組腸黏膜損傷嚴重，Sev較之明顯減輕，C組腸黏膜結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論 七氟烷預處理可顯著降低失血性休克豬血漿I-FABP、D-乳酸濃度和細菌移位，對腸黏膜屏障具有保護作用。

七氟烷；失血性休克；腸黏膜屏障；腸脂肪酸結(jié)合蛋白；D-乳酸；細菌移位

0 引言

失血性休克常引發(fā)心、腦、腎等重要器官功能障礙。最近研究表明，腸道不僅是失血性休克易損器官之一，腸黏膜缺血再灌注損傷引發(fā)的細菌移位更是休克病理生理發(fā)展過程中的重要不利因素[1]。目前，國內(nèi)外針對失血性休克后的腸道損傷主要采取對癥治療，但效果并不理想。而越來越多的研究顯示，圍手術期廣泛應用的七氟烷，不僅是高效的吸入性全身麻醉藥，更具有減輕心、肺、肝等重要器官缺血再灌注損傷的作用[2-4]。本研究以失血性休克豬為研究對象，觀察七氟烷預處理對其腸黏膜屏障功能損傷特異性指標I-FABP、D-乳酸和細菌移位的影響，探討七氟烷的腸黏膜屏障保護作用，為失血性休克時腸道缺血缺氧損傷的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年巴馬小型豬24頭(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物科提供)，雌雄不拘，體重22～25 kg，采用隨機數(shù)字表法均分為對照(C)組、失血性休克(S)組和七氟烷預處理(Sev)組，每組8頭。

1.2 模型制備及分組處理 麻醉前實驗動物禁食水8 h。各組動物經(jīng)耳緣靜脈注射丙泊酚3 mg/kg麻醉后，經(jīng)口氣管插管(ID 7.5 mm)，行機械通氣(芬蘭Ohmeda公司，Ohmeda 9300型)，呼吸頻率25次/min，潮氣量7 mL/kg，吸入氧濃度100%。四肢接心電圖導聯(lián)，連接多功能監(jiān)護儀(美國GE公司，Datex-Ohmeda S/5型)，并置直腸溫度探頭行體溫監(jiān)測。手術部位碘伏消毒，1%利多卡因局部麻醉下行雙側(cè)股動脈和右頸內(nèi)靜脈剖開置管。左側(cè)股動脈導管經(jīng)壓力換能器連接監(jiān)護儀，連續(xù)監(jiān)測動脈血壓。Sev組吸入七氟烷并保持2%呼出濃度30 min，C組和S組吸入空氣30 min。之后，S組和Sev組在15 min內(nèi)經(jīng)右側(cè)股動脈勻速放血30 mL/kg(相當于40%的總血容量)，制備容量控制性失血性休克模型[5]，C組不放血處理。

1.3 標本采集和測定 分別于麻醉前(T0)、休克后30 min(T1)、1 h(T2)、1.5 h(T3)、2 h(T4)、3 h(T5)和4 h(T6)，經(jīng)右頸內(nèi)靜脈采血3 mL，4 ℃下3 000 g離心10 min后，取上清液-80 ℃保存。采用ELISA法測定血漿I-FABP和D-乳酸含量(ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司)。休克4 h后放血處死動物，取空腸組織行HE組織病理學染色。無菌條件下取下腔靜脈血100 μL，接種于固體培養(yǎng)基。取腸系膜淋巴結(jié)、肝、肺、腎、脾組織稱重后，放入盛有l(wèi) mL生理鹽水的無菌研磨管中研成懸液，取20 μL接種于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后鑒定有無細菌生長及細菌種類，并計算遠隔器官細菌移位率，細菌移位率(%)=細菌移位陽性臟器個數(shù)/臟器總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 血漿I-FABP和D-乳酸含量的變化 與T0時點比較，S組和Sev組血漿I-FABP濃度在T1～T6時點均顯著增高(P<0.05)，且S組在T3時點達到峰值，Sev組在T4時點達到峰值，然后呈下降趨勢。組間比較，Sev組血漿I-FABP濃度在T1～T6時點均高于C組(P<0.05)，且低于S組(P<0.05)。與T0時點比較，S組和Sev組血漿D-乳酸濃度在T2～T6時點均顯著增高(P<0.05)，Sev組高于C組(P<0.05)，且低于S組(P<0.05)。見表1。

表1 三組各時點血漿I-FABP和D-乳酸濃度的變化(n=8)

注：與T0時比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與S組比較，#P<0.05

2.2 腸道細菌移位率檢測結(jié)果 三組從血、腸系膜淋巴結(jié)、肝、腎、肺、脾組織中共檢出大腸桿菌、腸球菌兩種細菌，均屬腸道常駐菌，見圖1。經(jīng)計算，Sev組遠隔器官細菌移位率低于S組(P<0.05)，高于C組(P<0.05)。見表2。

2.3 組織病理學觀察結(jié)果 HE染色顯示，C組腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，腺體絨毛刷狀緣整齊，黏膜無水腫充血。S組腸黏膜損傷嚴重，可見黏膜出血、大量上皮細胞壞死和炎細胞浸潤。Sev組較S組損傷明顯減輕，僅見輕度腺體擴張、上皮下間隙水腫和少量炎細胞浸潤。見圖2。

圖1 光鏡下檢出的遠隔臟器細菌種類

組別動物數(shù)(只)檢測臟器數(shù)(個)腸道細菌移位臟器數(shù)(個)血腸系膜淋巴結(jié)肝肺腎脾合計細菌移位率(%)C組84803100048．33S組8482887733572．92?Sev組8480855202041．67?#

注：與C組比較，*P<0.05；與S比較，#P<0.05

圖2 各組空腸組織病理學染色結(jié)果(HE，×10)

3 討論

急性失血是圍手術期低血容量休克的常見原因。其引發(fā)的循環(huán)血容量不足和紅細胞比容驟降，可導致心排血量減少、周圍血管收縮和血壓下降，進而促發(fā)器官氧供需失衡、組織無氧代謝和功能受損。既往針對失血性休克器官保護的研究，主要集中在心、腦等重要臟器。而新進研究顯示，機體為保障休克時心腦等重要器官的供血，腸循環(huán)常發(fā)生血液重新分布而更易出現(xiàn)低灌注。由于腸絨毛具有“逆流交換機制”等特點，使腸黏膜對缺血缺氧極為敏感而更易引發(fā)腸屏障受損[1]，進而導致腸道菌群大量移位至其他器官而加重休克。因此，腸黏膜屏障既是休克病理過程的“易受害者”，更是加劇休克的“發(fā)起者”。目前，臨床上針對休克引發(fā)的腸黏膜屏障損傷主要采用對癥治療，但療效不佳。而應用基于藥物的器官保護策略，可能針對病理損傷機制而發(fā)揮良好的防治作用。

七氟烷是臨床上常用的吸入麻醉藥。研究表明，其對心、腦、肝、腎等器官具有保護作用[2-4]。Rodriguez-lopez等[6]研究顯示，七氟烷可明顯減少豬主動脈手術過程中低血壓和酸中毒的發(fā)生。而Stumpner等[7]的研究證實，七氟烷通過COX-2介導而減少心肌梗死的面積。由于失血性休克和心臟手術過程中的體外循環(huán)有相似的病理生理過程，本研究選用七氟烷，以觀察其對失血性休克腸黏膜屏障的保護作用。過高濃度的七氟烷吸入可能產(chǎn)生心肌抑制和血壓下降而加重休克，且圍手術期失血性休克常發(fā)生于全麻30 min以后的手術過程中，因此本研究選用預先吸入2%(1 MAC)七氟烷30 min的預處理方式。組織病理學染色結(jié)果顯示，失血性休克4 h后S組腸黏膜屏障顯著受損，Sev組較其明顯減輕。表明七氟烷預處理可明顯改善失血性休克引發(fā)的腸黏膜屏障破壞。

I-FABP是哺乳動物腸道黏膜微絨毛組織內(nèi)獨有的低分子蛋白質(zhì)，因其在腸黏膜缺血、缺氧早期即可大量釋放入血，所以近年來被認為是診斷腸損傷的早期敏感指標[8]。有研究顯示，手術結(jié)束時，高濃度血清IFABP對診斷腸壞死的敏感性為100%、特異性為98.1%[9]。本研究中，S組血漿I-FABP濃度在失血性休克后30 min即開始增加，1.5 h達峰值，并持續(xù)至4 h以上。Sev組血漿I-FABP濃度不僅顯著低于S組，且血漿峰值延后至休克后2 h，表明七氟烷預處理不僅減輕、而且延緩了失血性休克腸黏膜屏障破壞的發(fā)展。

哺乳動物體內(nèi)D-乳酸主要由腸道內(nèi)菌群發(fā)酵生成，因此，腸屏障破壞時，其血漿濃度迅速上升。Sobhian等[10-11]研究顯示，D-乳酸是預測失血性休克腸道損傷和預后的重要指標。本研究中，S組血漿D-乳酸濃度在失血性休克后1 h開始增高，晚于I-FABP的升高時間，表明在預測腸屏障損傷方面，D-乳酸指標稍滯后于I-FABP。由于Sev組在休克后4 h血漿D-乳酸濃度較休克后1 h升高，雖明顯低于S組，但仍高于C組，表明七氟烷預處理并未完全阻止失血性休克引發(fā)的腸黏膜屏障破壞，或者由于腸道內(nèi)菌群移位至全身而上調(diào)了D-乳酸濃度。

失血性休克發(fā)生后，腸黏膜屏障的嚴重受損可導致腸道正常菌群或內(nèi)毒素向腸外轉(zhuǎn)移而加重休克。因此，保護腸黏膜屏障功能，減少細菌與毒素移位，是低血容量休克治療的重點[12]。研究表明，機體免疫功能受抑、腸黏膜免疫屏障受損，是細菌移位的重要條件和主要原因[13]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，臨床上常用的吸入麻醉藥均可抑制單核和巨噬細胞釋放細胞因子而發(fā)揮抗炎作用[14]。亦有研究表明，七氟烷預處理可以通過抑制炎癥反應而降低感染性休克大鼠的死亡率[15]。本研究中，S組血液、肝、腎等臟器中檢出2種腸道菌群，Sev組細菌移位率明顯低于S組，表明七氟烷預處理可明顯降低失血性休克引發(fā)的腸道細菌移位，提示七氟烷可能通過減輕失血性休克引發(fā)的炎性反應而改善腸屏障功能。

本研究中，Sev組血漿I-FABP、D-乳酸濃度和細菌移位雖明顯低于S組，但仍明顯高于C組，說明2%七氟烷30 min預處理，能減輕但不能完全阻止失血性休克豬腸黏膜屏障損傷的發(fā)生。增加七氟烷吸入濃度和吸入時間、七氟烷預處理是否可以完全阻止失血性休克引發(fā)的腸黏膜屏障損傷，需要進一步研究證實。

綜上所述，七氟烷預處理可顯著降低失血性休克豬血漿I-FABP、D-乳酸濃度和細菌移位，對腸黏膜屏障具有保護作用。

[1] Brandt LJ,Boley SJ.AGA technical review on intestinal ischemia[J].Gastroenterology,2000,118(5):954-968.

[2] Warltier DC,Al-Wathiqui MH,Kampine JP,et al.Recovery of contractile function of stunned myocardium in chronically instrumented dogs is enhanced by halothane or isoflurane[J].Anesthesiology,1988,69(4):552-565.

[3] Kalimeris K,Zerva A,Matsota P,et al.Pre-treatment with sevoflurane attenuates direct lung injury[J].Minerva Anestesiol,2014,80(6):635-644.

[4] Bedirli N,Ofluoglu E,Kerem M,et al.Hepatic energy metabolism and the differential protective effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia in a rat hepatic ischemia-reperfusion injury model[J].Anesthesia & Analgesia,2008,106(3):830-837.

[5] Wu X,Kochanek PM,Cochran K,et al.Mild hypothermia improves survival after prolonged,traumatic hemorrhagic shock in pigs[J].AJ Trauma,2005,59(2):291-299.

[6] Rodriguez-Lopez JM,Sanchez-Conde P,Lozano FS,et al.Laboratory investigation:effects of propofol on the systemic inflammatory response during aortic surgery[J].Canadian Journal of Anesthesia,2006,53(7):701-710.

[7] Stumpner J,Tischer-Zeitz T,Frank A,et al.The role of cyclooxygenase-1 and-2 in sevoflurane-induced postconditioning against myocardial infarction[J].Semin Cardiothorac Vasc Anesth,2014,18(3):272-280.

[8] Adriaanse MP,Tack GJ,Passos VL,et al.Serum I-FABP as marker for enterocyte damage in coeliac disease and its relation to villous atrophy and circulating autoantibodies[J].Alimentary Pharmacology & Therapeutics,2013,37(4):482-490.

[9] Windsant IC,Hellenthal FA,Derikx JP,et al.Circulating intestinal fatty acid-binding protein as an early marker of intestinal necrosis after aortic surgery:a prospective observational cohort study[J].Annals of Surgery,2012,255(4):796-803.

[10]Evennett NJ,Petrov MS,Mittal A,et al.Systematic review and pooled estimates for the diagnostic accuracy of serological markers for intestinal ischemia[J].World Journal of Surgery,2009,33(7):1374-1383.

[11]Sobhian B,Kr?pfl A,H?lzenbein T,et al.Increased circulating D-lactate levels predict risk of mortality after hemorrhage and surgical trauma in baboons[J].Shock,2012,37(5):473-477.

[12]曹國龍,程愛國,張小平.失血性休克中腸屏障的損傷[J].華北煤炭醫(yī)學院學報,2006,8(2):168-170.

[13]Brenchley JM,Douek DC.Microbial translocation across the GI tract[J].Annu Rev Immunol,2012,30(1):149-173.

[14]Hofstetter C,Flondor M,Boost KA,et al.A brief exposure to isoflurane (50 s) significantly impacts on plasma cytokine levels in endotoxemic rats[J].International Immunopharmacology,2005,5(10):1519-1522.

[15]Hiltebrand LB,Koepfli E,Kimberger O,et al.Hypotension during fluid-restricted abdominal surgery:effects of norepinephrine treatment on regional and microcirculatory blood flow in the intestinal tract[J].Anesthesiology,2011,114(3):557-564.

Effect of sevoflurane preconditioning on the concentration of plasma I-FABP and D-lactate and bacterial translocation in hemorrhagic shock pigs

WANG Li-jing,SUN Ying-jie,DIAO Yu-gang,ZHANG Tie-zheng,JIN Qiang*

(Department of Anesthesiology,The General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China)

Objective To investigate the effect of sevoflurane preconditioning on the concentration of plasma I-FABP and D-lactate and bacterial translocation in hemorrhagic shock pigs.Methods Twenty four Bama miniature pigs with male and female informal were equally divided into control (C) group,hemorrhagic shock (S) group and sevoflurane precondition (Sev) group using random number table method.Pigs from group Sev inhaled 2% sevoflurane 30 min while animals from group C and group S inhaled air.Afterwards, the hemorrhagic shock model was established in group S and group Sev.The concentration of plasma I-FABP and D-lactate were measured using ELISA method before anesthesia (T0) and at 30 min (T1),1 h (T2),1.5 h (T3),2 h (T4),3 h (T5),4 h (T6) after the hemorrhagic shock model was made.The jejunum sample was obtained for HE staining at T6,and the inferior vena venous blood,mesenteric lymph nodes,live,lung,kidney and spleen samples were obtained for bacterial culture at the same time.Afterwards,the bacterial translocation rate was calculated.Results The concentration of plasma D-lactate,I-FABP and the rate of bacterial translocation in group Sev were lower than those of group S (P<0.05) and higher than those of group C (P<0.05).HE staining showed obvious intestinal mucosa injury in group S.The injury was alleviated in group Sev while the tissue structure in group C was normal.Conclusion Sevoflurane preconditioning can significantly decrease the concentration of plasma I-FABP,D-lactate and bacterial translocation,and has gut mucosal barrier protection effect on hemorrhagic shock pigs.

Sevoflurane;Hemorrhagic shock;Gut mucosal barrier;I-FABP;D-lactate;Bacterial translocation

2015-04-18

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，沈陽 110016

軍隊后勤科研重點項目(BWS12J008)；國家自然科學基金(81471121)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511001

*通信作者