表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯

錢俊青，李尚謙，仲 翔，郭 輝

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310032）

表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯

錢俊青，李尚謙，仲 翔，郭 輝

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310032）

為提高假絲酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的催化效率，采用兩相體系中加入表面活性劑形成膠束溶液，然后優(yōu)化假絲酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯工藝條件。研究表明，與不加表面活性劑的對(duì)照組相比，表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨存在的實(shí)驗(yàn)組，反應(yīng)的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有明顯提升。假絲酵母脂肪酶在該體系中催化合成蔗糖-6-乙酯的優(yōu)化工藝條件為：反應(yīng)介質(zhì)為仲丁醇/水，其中水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，表面活性劑的濃度為10 mmol/L，乙酸乙烯酯與蔗糖物質(zhì)的量比為3∶1，反應(yīng)pH值9，溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間4 h。在此反應(yīng)條件下，得到蔗糖乙酯酯化率為71.2%，其中蔗糖-6-乙酯選擇性為56.4%。

表面活性劑；脂肪酶；酯化；蔗糖-6-乙酯

蔗糖-6-乙酯是合成三氯蔗糖的關(guān)鍵中間體［1-3］。三氯蔗糖是目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量快速增長(zhǎng)的功能性甜味劑，具有甜度高、無能量、味質(zhì)好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是肥胖癥、心血管病和糖尿病患者理想的輔助治療產(chǎn)品，應(yīng)用前景廣闊［4-6］。蔗糖有八個(gè)羥基，每個(gè)羥基都能被親電試劑?；a(chǎn)生不同取代位置、不同取代度的蔗糖酯，因此，如何選擇性高效合成蔗糖酯是國(guó)內(nèi)外研究的難點(diǎn)。目前合成蔗糖酯常用化學(xué)法和酶法，化學(xué)法易于工業(yè)化生產(chǎn)，但由于蔗糖的8個(gè)羥基反應(yīng)活性相近，所以酯化反應(yīng)作用位點(diǎn)較難控制［7-8］，要得到特定位點(diǎn)酯化的單一產(chǎn)物往往比較困難，需要冗長(zhǎng)的保護(hù)和去保護(hù)步驟；此外，化學(xué)合成中多種有毒試劑的使用在一定程度上降低了產(chǎn)品的食品安全性。這些弊端促使較多的學(xué)者將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向酶法合成蔗糖酯。酶法合成可利用蔗糖直接酯化的方法，具有合成路線短，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，而良好的區(qū)域選擇性更是酶催化合成的特色，因此酶法合成越來越被廣泛地研究和應(yīng)用［9-11］。

已有文獻(xiàn)表明，在含水體系中可以進(jìn)行酯化反應(yīng)，而且通常反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到較大的酯化率［12-14］。由于蔗糖在水中的溶解度明顯高于有機(jī)溶劑，可顯著提高反應(yīng)底物濃度，提高反應(yīng)效率，因此，含水兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯具有良好的應(yīng)用前景。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，表面活性劑可以大大增加兩相體系中兩相間的合成反應(yīng)速率，減少副反應(yīng)的發(fā)生，增加目標(biāo)化合物的選擇性［15-17］。表面活性劑在其濃度超過臨界膠束濃度（CMC）后會(huì)形成膠束，對(duì)有機(jī)相中的物質(zhì)起到水相增溶作用，可擴(kuò)大兩相界面間接觸，同時(shí)還受到局部濃集效應(yīng)、靜電效應(yīng)、極性效應(yīng)等影響，能夠有效促進(jìn)合成反應(yīng)在兩相中的進(jìn)行。本研究是采用水與有機(jī)溶劑兩相體系中加入表面活性劑形成膠束溶液，以假絲酵母脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)，探索了假絲酵母脂肪酶在該體系中催化合成蔗糖-6-乙酯的工藝過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖及所有有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；假絲酵母脂肪酶（candida rugosa lipase，CRL）（10 000 U/g），購(gòu)于北京高瑞森科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；Alltech 3300型蒸發(fā)光檢測(cè)儀（ELSD），美國(guó)格雷斯公司；TH2-82A型恒溫水浴振蕩器，金壇市江南儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蔗糖-6-乙酯合成方法

將4 mmol蔗糖、0.1 g酶、12 mmol乙酸乙烯酯、0.1 mmol表面活性劑、6 mL蒸餾水、4 mL醇類溶劑置于50 mL具塞三角瓶中，放入恒溫?fù)u床，180 r/min振蕩。35℃條件下反應(yīng)5 h，每隔一定時(shí)間用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液至初始pH值。

1.3.2 產(chǎn)物分析方法

采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLCELSD）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴5 min使得脂肪酶失活，其中反應(yīng)液中的有機(jī)溶劑基本可揮發(fā)除去，將剩余的反應(yīng)液定容至100 mL，膜過濾后進(jìn)行高效液相分析，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。色譜條件:ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×250 mm，5 μm，流動(dòng)相:去離子水，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL。蒸發(fā)光檢測(cè)器溫度85℃，氮?dú)饬魉?.5 L/min。記錄色譜圖，計(jì)算酯化率和蔗糖-6-乙酯的選擇性，見式（1）、式（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑種類對(duì)反應(yīng)的影響

表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)和極性是影響兩相體系膠束催化的重要因素。實(shí)驗(yàn)組中分別加入陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十二烷基硫酸鈉（SDS），非離子表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（Tween-80）、失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span-80），以及不加表面活性劑的空白對(duì)照樣品，觀察在兩相體系中表面活性劑種類對(duì)蔗糖-6-乙酯合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 不同表面活性劑種類對(duì)合成蔗糖-6乙酯反應(yīng)的影響Tab.1 Influences of different type of surfactants on synthesis of sucrose-6-acetate%

由表1可知，加入陽離子表面活性劑CTAB，酯化率比空白對(duì)照提高許多，原因一是因形成的膠束產(chǎn)生了反應(yīng)界面擴(kuò)大效應(yīng)，使反應(yīng)物之間接觸概率大增；二是因在偏堿性催化酯交換反應(yīng)中，陽離子表面活性劑形成的膠束的正電荷能使反應(yīng)中間體（帶負(fù)電荷）易于形成。同理，由于陰離子表面活性劑形成的膠束所帶的負(fù)電荷不利于反應(yīng)中間體的形成，其酯化率比空白組有所下降。非離子表面活性劑形成的膠束不帶電，對(duì)中間體產(chǎn)生無影響，所得到的酯化率比空白組略有提高。同時(shí)，我們觀察到加入表面活性劑CTAB的實(shí)驗(yàn)組具有較高的蔗糖-6-乙酯選擇性，因此，表面活性劑選擇為CTAB。

2.2 兩相體系中有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)的水和有機(jī)溶劑兩相體系中，由于有機(jī)溶劑極性的差異，使其與底物形成不同空間取向的結(jié)合，從而使酶與底物形成不同的活性中間態(tài)而影響產(chǎn)物的生成。本實(shí)驗(yàn)選取了無毒性的醇類有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2可知，選擇仲丁醇-水兩相體系作為反應(yīng)介質(zhì)，合成蔗糖-6-乙酯時(shí)具有較高的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性，這可能與仲丁醇的剛性結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此選取仲丁醇作為反應(yīng)體系中的有機(jī)溶劑。

2.3 兩相體系中水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)的影響

水質(zhì)量分?jǐn)?shù)是兩相體系中合成蔗糖酯的一個(gè)重要因素。相比于有機(jī)溶劑，蔗糖在水中具有非常好的溶解性，增加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以提高反應(yīng)體系的傳質(zhì)，但水的存在也會(huì)引起反應(yīng)底物乙酸乙烯酯和產(chǎn)物蔗糖-6-乙酯的水解。因此考察了水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶催化合成蔗糖-6-乙酯的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

表2 有機(jī)溶劑對(duì)合成蔗糖-6-乙酯反應(yīng)的影響Tab.2 Influences of organic solvents on synthesis of sucrose-6-acetate%

圖1 水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)合成蔗糖-6-乙酯的影響Fig.1 Influences of water content on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖1可知，隨著體系中水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，反應(yīng)產(chǎn)物酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有所提高，在水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，酯化率達(dá)到最大；超過60%后，酯化率顯著下降，蔗糖-6-乙酯選擇性也有所下降。故體系中水質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為60%。

2.4 底物物質(zhì)的量比對(duì)反應(yīng)的影響

乙酸乙烯酯是較為活潑的?；w。在蔗糖轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中，若乙酸乙烯酯的量超過一定的范圍，會(huì)繼續(xù)與產(chǎn)物蔗糖單酯發(fā)生反應(yīng)，生成蔗糖多酯。因此乙酸乙烯酯的加入量會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生重要的影響，選擇不同底物物質(zhì)的量比（乙酸乙烯酯/蔗糖），考察其對(duì)蔗糖-6-乙酯合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

由圖2可知，隨著乙酸乙烯酯與蔗糖物質(zhì)的量比的增加，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性同時(shí)升高，當(dāng)物質(zhì)的量比超過3時(shí)，蔗糖-6-乙酯選擇性開始下降，其原因是蔗糖分子上其他位羥基接觸到乙酸乙烯酯活性中間體的機(jī)會(huì)增加，影響選擇性，且過多的乙酸乙烯酯水解不利于對(duì)體系pH值的控制，也影響酯化率。因此實(shí)驗(yàn)中采取底物物質(zhì)的量比為3∶1。

2.5 體系pH值對(duì)反應(yīng)的影響

pH值對(duì)酶的活性具有極為顯著的影響，通常酶只有在一定的pH值范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出活性。選用6 mol/L NaOH將去離子水的pH值調(diào)成一定梯度，考察體系pH值對(duì)蔗糖-6-乙酯合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖2 底物物質(zhì)的量比對(duì)蔗糖乙酯合成的影響Fig.2 Influences of molar ratio of substrates on synthesis of sucrose-6-acetate

圖3 反應(yīng)pH值對(duì)蔗糖-6-乙酯合成的影響Fig.3 Influences of pH on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖3可知，體系pH值對(duì)蔗糖-6-乙酯的合成影響較大。當(dāng)pH值低于7時(shí)，即在偏酸性環(huán)境時(shí)，酯化率很低，然后隨著pH值的增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都不斷上升。當(dāng)pH值達(dá)到9.0時(shí)，酯化率和蔗糖6-乙酯選擇性同時(shí)達(dá)到最大，此后又隨著pH值的進(jìn)一步增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都出現(xiàn)較快下降。其原因是pH值過低或過高，都會(huì)使生成的蔗糖酯更易發(fā)生水解，并會(huì)使脂肪酶失活。

2.6 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

在酶催化反應(yīng)中，溫度的改變直接影響著酶的催化活性。溫度過低時(shí)，酶催化活性較低，催化速率較慢；當(dāng)溫度過高時(shí)，酶可能因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變而失活。選擇不同的反應(yīng)溫度，研究不同溫度條件下蔗糖-6-乙酯的合成情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酯化率的影響Fig.4 Influences of reaction temperature on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖4可知，隨著溫度的升高，酶的活性上升，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都達(dá)到最大。而后再升高溫度，酶活性開始下降，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性也隨之下降。故選擇35℃為本反應(yīng)體系中的最適反應(yīng)溫度。

2.7 時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

在兩相體系中加入表面活性劑形成膠束反應(yīng)體系，可以顯著地增加兩相間反應(yīng)物的反應(yīng)速率。因此，對(duì)不同時(shí)間酯化率以及蔗糖-6-乙酯選擇性的變化情況加以考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響Fig.5 Influences of reaction time on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到4 h時(shí)，酯化率達(dá)到71.2%，蔗糖-6-乙酸酯選擇性為56.4%。隨著反應(yīng)繼續(xù)，酯化率的變化不再明顯，這表明在本反應(yīng)體系中比傳統(tǒng)有機(jī)溶劑中合成蔗糖酯的反應(yīng)速率要快許多。4 h后蔗糖-6-乙酯選擇性下降較為明顯，其原因是生成的蔗糖單酯已轉(zhuǎn)化為蔗糖多酯，導(dǎo)致蔗糖-6-乙酯選擇性下降。

3 結(jié) 語

探索了表面活性劑存在下，在水-仲丁醇兩相體系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)加入表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）后，脂肪酶在膠束體系中催化合成蔗糖-6-乙酯較雙水相體系的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有較大提升。經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的反應(yīng)工藝條件為:反應(yīng)介質(zhì)為仲丁醇/水，其中水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，乙酸乙烯酯與蔗糖物質(zhì)的量比為3∶1，反應(yīng)pH值9.0，溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間4 h。在此反應(yīng)條件下，得到蔗糖乙酯酯化率為71.2%，其中蔗糖-6-乙酯選擇性為56.4%。本研究的反應(yīng)體系以及工藝優(yōu)化條件可為酶法催化合成蔗糖-6-乙酯提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)利用甜味劑三氯蔗糖提供理論指導(dǎo)。

［1］唐振興，石陸娥.三氯蔗糖合成研究進(jìn)展［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2006，34（6）:10-15.

［2］Jones J D，Hacking A J，Cheetham P S J.Biological method for protection of 6-position of sucrose and its use in synthesis of disaccharide high-intensity sweetener［J］. Biotechnology and Bioengineering，1992，39（2）:203-210.

［3］Han Y，Liu G，Huang D，et al.Study on the synthesis of sucrose-6-acetate catalyzed by fructosyltransferase from Aspergillus oryzae［J］.New Biotechnology，2011，28（1）:14-18.

［4］梁誠(chéng).高效甜味劑三氯蔗糖的應(yīng)用與合成［J］.中國(guó)氯堿，2001（9）:23-24.

［5］Grice H C，Goldsmith L A.Sucralose:an overview of the toxicity data［J］.Food and Chemical Toxicology，2000，38:1-6.

［6］沈云飛，馬正智，李慧，等.三氯蔗糖的特性及其在食品中的應(yīng)用［J］.中國(guó)食品添加劑，2007（4）:132-137.

［7］Garegg P J，Oscarson S，Ritzen H.Partially esterified sucrose derivatives:synthesis of 6-O-acetyl-2，3，4-tri-O-［（S）-3-methylpentanoyl］sucrose，a naturally occurring flavour precursor of tobacco［J］.Carbohydrate Research，1988，181:89-96.

［8］Oscarson S，Ritzen H.Synthesis of 6-O-acetyl-2，3，4-tri-O-3-methylpentanoyl sucrose and the three regioisomers of 6-O-acetyl-2，3，4-tri-O-3-methylpentanoyl sucrose，naturally occurring fatty acid esters of sucrose found in tobacco［J］.Carbohydrates Research，1996，284（2）:271-277.

［9］Shi Y，Li J，Chu Y H.Enzyme-catalyzed regioselective synthesis of sucrose-based esters［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2011，86（12）:1457-1468.

［10］Li G，Cai Y，Hao Z，et al.Synthesis of sucrose acetate using a solvent-stable serine protease from Serratia sp. SYBC H［J］.Engineering in Life Sciences，2011，11（6）:615-619.

［11］Kennedy J F，Kumar H，Panesar P S，et al.Enzymecatalyzed regioselective synthesis of sugar esters and related compounds［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2006，81（6）:866-876.

［12］Bottarelli P，Costa M.Organometallic catalysis in aqueous-organic two-phase systems:rhodium-catalyzed coupling reaction of but-3-enoic acid with allyl derivatives，influence of the reaction media［J］.Journal of Molecular Catalysis A:Chemical，2008，289（1）:82-90.

［13］Kremnicky L，Biely P.Unique mode of acetylation of oligosaccharides in aqueous two-phase system by Trichoderma reesei acetyl esterase［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2005，37（1）:72-78.

［14］Xiang Zhong，Junqing Qian，Min Liu，et al.Candida rugosa lipase-catalyzed synthesis of sucrose-6-acetate in a 2 butanol/buffer two-phase syetem［J］.Engineering in Life Sciences，2013，13:813-818.

［15］賈承勝，張印，徐菁苒，等.植物甾醇脂肪酸酯的膠束催化合成研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，30（6）:894-898.

［16］高保嬌，張昕，劉啟發(fā).有機(jī)電解質(zhì)在膠束催化聚苯乙烯氯甲基化反應(yīng)中的作用［J］.物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（1）:86-91.

［17］Carvalho C M L，Cabral J M S.Reverse micelles as reaction media for lipases［J］.Biochimie，2000，82（11）:1063-1085.

Enzymatic Synthesis of Sucrose-6-Acetate in Two-Phase Medium with Surfactant

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，GUO Hui（School of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In order to increase the yield of sucrose-6-acetate which is catalysed by candida rugosa lipase，the method of this paper was that the surfactant was added into the two-phase system to formate the micelles，then use the candida rugosa lipase as catalyst to synthesis sucrose-6-acetate.The results showed that compared with the control group，the esterification rate and sucrose-6-acetate rate significantly increased in surfactant cetyltrimethyl ammonium bromide group.The optimum conditions as followed:reaction medium is butanol/H2O，content of water is 60%，the concentration of surfactant is 10 mmol/L，n（vinyl acetate）∶n（sucrose）is 3∶1，pH 9，reaction at 35℃for 4 h.The sucrose acetate esterification rate is 71.2%，the selectivity of sucrose-6-acetate is 56.4%.

surfactant；lipase；esterification；sucrose-6-acetate

葉紅波）

TS202；Q814.9

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.005

2095-6002（2015）04-0022-05

錢俊青，李尚謙，仲翔，等.表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（4）:22-26.

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，et al.Enzymatic synthesis of sucrose-6-acetate in two-phase medium with sur factant［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:22-26.

2015-05-19

錢俊青，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品酶法加工方面的研究。