替普瑞酮對胃上皮細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響＊

劉 浪，劉 丹，袁偉建，李新華，許 明

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長沙410008）

替普瑞酮又名二牛龍牛兒基丙酮，是眾所周知的胃黏膜保護(hù)劑，能夠促進(jìn)損傷胃黏膜的再生修復(fù)［1］。人們發(fā)現(xiàn)替普瑞酮的黏膜保護(hù)作用最初是由于它能促進(jìn)消化性潰瘍的愈合，而消化性潰瘍的愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包括胃上皮細(xì)胞增殖和遷移，腺體重建，肉芽組織形成，新生血管形成等，其中胃上皮細(xì)胞增殖和遷移覆蓋損傷面是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［2］，而胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡減少，使胃黏膜對損傷因子的抵抗能力增強(qiáng)，損傷不再進(jìn)一步加重。為此，本研究以人正常胃上皮細(xì)胞為對象，著重探討替普瑞酮對胃上皮細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的直接影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1培養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心；替普瑞酮粉劑（日本衛(wèi)材公司）用無水乙醇溶解后，無血清RPMI1640稀釋配成5 000μmol／L 的母液，并且使乙醇的最終濃度為0.01%；Transwell試劑盒（美國Corning 公 司）；Annexin V／APC凋亡檢測試劑盒（美國Ebioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100μmol／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素，pH 7.4），置37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞增殖活性 將處于對數(shù)生長期的人胃黏膜上皮細(xì)胞以每孔4×103接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，培養(yǎng)24h貼壁后分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160、320μmol／L）的替普瑞酮。分別連續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72h和96 h后，加入MTT（5mg／mL）20μL，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜（DMSO）150μL，室溫振蕩10min溶解。以490nm 為測定波長，用酶標(biāo)儀檢測OD490值。各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 以含乙醇（濃度為0.01%）的RPMI1640 為對照組，將替普瑞酮（80μmol／L）和等體積含乙醇的RPMI1640與對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞作用24h后，0.25%胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106／mL；取細(xì)胞懸液100μL 分別接種到各組Transwell小室中，再往實(shí)驗(yàn)組Transwell小室中加入替普瑞酮，對照組加入等體積含乙醇的RPMI1640，調(diào)整最終小孔內(nèi)液體積為200μL（最終替普瑞酮濃度為80μmol／L，乙醇濃度為0.01%）；于下室加入600μL含30%胎牛血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)室，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h。同時(shí)，每組各設(shè)置一孔細(xì)胞作為參照：同樣吸取100μL 細(xì)胞懸液，進(jìn)行MTT藥物處理后染色，檢測OD470值（3復(fù)孔／組）。取出小室去除培養(yǎng)基和非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，將小室浸泡在Giesma染液中20min，再將小室沖洗、晾干后顯微鏡下拍照，然后用10% 醋酸脫色，洗脫液在酶標(biāo)儀上570nm 測其OD570值，計(jì)算并比較兩組細(xì)胞遷移率，遷移率＝Giesma染色后OD570值／接種時(shí)OD470值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞長滿單層后，分別用最佳濃度（80μmol／L）的替普瑞酮和乙醇溶劑（濃度0.01%）預(yù)處理24h的胃上皮細(xì)胞做劃痕實(shí)驗(yàn)（3復(fù)孔／組），用10μL 槍頭在中間劃一橫線，使用無血清培養(yǎng)基輕輕漂洗2次，加入低濃度血清培養(yǎng)基，減少細(xì)胞增殖的影響，分別于0、8、24h鏡下觀察并拍照，并應(yīng)用NIS-Elements檢驗(yàn)軟件檢測兩組細(xì)胞遷移的寬度差異，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率，遷移率為拍照時(shí)間點(diǎn)遷移距離與“0h”劃痕區(qū)寬度值的比值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 以含乙醇（濃度為0.01%）的RPMI1640為對照組，替普瑞酮（濃度80μmol／L）作用對數(shù)生長期的胃上皮細(xì)胞48h后，0.25%胰酶消化，冷PBS液洗滌2次，1 500r／min離心5min，收集細(xì)胞，加入適量染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106～1×107／mL，取細(xì)胞懸液100μL加入5μL Annexin V-APC 染色液，室溫避光15min，再加入PI染色液，輕輕混勻，避光放置10 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況（3復(fù)孔／組），凋亡率＝（早期凋亡細(xì)胞數(shù)＋晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)觀察替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞增殖能力的影響 用不同濃度替普瑞酮（0、10、20、40、80、160、320μmol／L）處理胃上皮細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72和96h后分別測定OD490值，采用單因素方差分析法比較藥物作用96h后各組細(xì)胞間的增殖差異，結(jié)果顯示10μmol／L替普瑞酮組的胃上皮細(xì)胞的增殖能力明顯高于0μmol／L組（P＜0.05），20μmol／L 組明顯高于10μmol／L組（P＜0.05），40μmol／L 組明顯高于20 μmol／L組（P＜0.05），80、160、320μmol／L 組均明顯高于40 μmol／L組（P＜0.05），而80、160、320μmol／L 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。結(jié)果表明，在0～80μmol／L 范圍內(nèi)，隨著替普瑞酮濃度增加，胃正常上皮細(xì)胞的增殖能力隨之增強(qiáng)；繼續(xù)加大替普瑞酮濃度，胃正常上皮細(xì)胞的增殖無明顯變化。由此可見，替普瑞酮明顯促進(jìn)胃正常上皮細(xì)胞增殖，同時(shí)，選擇80μmol／L為最佳藥物濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞遷移能力的影響

2.2.1 Transwell實(shí)驗(yàn) 替普瑞酮（80μmol／L）處理胃正常上皮細(xì)胞24h，Giemsa染色觀察轉(zhuǎn)移至Transwell小室膜下側(cè)面的細(xì)胞，細(xì)胞被染成藍(lán)紫色，染色的程度反應(yīng)遷移細(xì)胞的數(shù)量，將膜下側(cè)面的細(xì)胞進(jìn)行OD570檢測，利用接種時(shí)的參照孔細(xì)胞OD470值計(jì)算遷移率。加藥組細(xì)胞的遷移率為3.338±0.293，對照組細(xì)胞的遷移率為1.328±0.208，加藥組細(xì)胞遷移率明顯高于對照組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞遷移率的影響（×400）

2.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)加藥組（80 μmol／L）和對照組細(xì)胞并觀察劃痕周圍細(xì)胞向中間空白區(qū)遷移情況，分別測量0、8、24h兩組細(xì)胞劃痕區(qū)的寬度，以此計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率，替普瑞酮作用8h后，加藥組的遷移率為0.54±0.20，對照組為0.38±0.03，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而替普瑞酮作用24h后，加藥組細(xì)胞已經(jīng)完全遷移覆蓋劃痕區(qū)，遷移率為1.00±0.18，對照組遷移率為0.72±0.08，加藥組遷移率明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)觀察替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞凋亡的影響 替普瑞酮（80μmol／L）處理細(xì)胞48h后，Annexin-V／PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，如圖4所示，凋亡圖右下象限（FITC＋／PI-）為早期凋亡細(xì)胞，右上象限（FITC＋／PI＋）為晚期凋亡細(xì)胞，左下象限（FITC-／PI-）為正?；罴?xì)胞。加藥組與對照組比較，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞明顯減少；加藥組細(xì)胞凋亡率為（11.90±1.53）%，對照組細(xì)胞凋亡率為（25.61±0.15）%，加藥組細(xì)胞凋亡率低于對照組（P＜0.01）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測替普瑞酮對胃正常上皮細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

替普瑞酮是眾所周知的胃黏膜保護(hù)劑，在臨床廣泛用于急慢性胃炎、胃潰瘍的治療，但其胃黏膜保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不明確。既往以動(dòng)物模型為研究對象，結(jié)果表明替普瑞酮不僅能上調(diào)前列腺素E2、NO、己糖胺的表達(dá)，下調(diào)內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達(dá)，增強(qiáng)胃黏膜血流和加強(qiáng)黏液碳酸氫鹽屏障，還能降低胃黏膜溶酶體酶活性和減輕脂質(zhì)過氧化，減輕胃黏膜損傷［3-4］。Ishihara等［5］、Watanabe等［6］和Isoir等［7］以 動(dòng) 物 胃 黏 膜 細(xì) 胞為模型進(jìn)一步從細(xì)胞水平，證明了替普瑞酮能夠促進(jìn)胃上皮細(xì)胞增殖及遷移，以及Suemasu等［8］和Takano等［9］以鼠和豬等胃黏膜上皮細(xì)胞為研究對象，證明了替普瑞酮能夠顯著降低胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，從而起到促進(jìn)潰瘍愈合、減輕胃黏膜細(xì)胞損傷的作用。而以上研究均以動(dòng)物模型或動(dòng)物胃黏膜細(xì)胞為研究對象，與人胃黏膜細(xì)胞存在一定的差異，本研究首次選用人胃黏膜上皮細(xì)胞為研究對象并成功證明了替普瑞酮能夠促進(jìn)人正常胃上皮細(xì)胞增殖及遷移，抑制人正常胃上皮細(xì)胞凋亡，從細(xì)胞水平上對替普瑞酮的胃黏膜保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

胃上皮細(xì)胞系源于人胎兒正常胃黏膜上皮細(xì)胞用SV40病毒感染轉(zhuǎn)化而建立，保留了人正常胃黏膜上皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，接種于裸鼠6個(gè)月無致瘤性，適宜于各種致病因子及藥物等對其損傷或保護(hù)作用機(jī)制的研究［10］，已得到廣泛應(yīng)用。例如，有研究通過體外培養(yǎng)胃上皮細(xì)胞探討三葉肽因子、中藥制劑等對胃黏膜上皮的保護(hù)作用及分子機(jī)制［11-12］，也有研究以胃上皮為細(xì)胞模型探討氯吡格雷、幽門螺桿菌等對胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷作用及分子機(jī)制［13-14］。與以往動(dòng)物胃黏膜細(xì)胞相比，該細(xì)胞系消除了物種之間可能的生物差異性，與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞機(jī)能更為接近，為進(jìn)一步探討替普瑞酮對胃黏膜保護(hù)的相關(guān)信號(hào)通路和靶分子機(jī)制提供了一個(gè)更好的細(xì)胞模型。

該研究結(jié)果表明，用不同濃度替普瑞酮處理人胃正常上皮細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，且在一定范圍內(nèi)隨著濃度增加，作用越明顯，具有一定濃度依賴性；同時(shí)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)表明加入替普瑞酮后胃正常上皮細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，替普瑞酮促進(jìn)胃上皮細(xì)胞增殖和遷移的作用，不僅有利于消化性潰瘍的愈合，同時(shí)對于改善再生黏膜修復(fù)質(zhì)量也具有重要意義。研究還表明，替普瑞酮有抗腫瘤作用［15］。然而，這一系列的分子機(jī)制目前還不清楚。據(jù)以往研究，Ishihara等［5］成功證明替普瑞酮通過誘導(dǎo)HSP70的高表達(dá)促進(jìn)潰瘍邊緣細(xì)胞增殖和遷移以及新生血管及組織不斷形成，從而加速潰瘍的愈合。最新的研究顯示mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化能促進(jìn)胃上皮細(xì)胞的遷移［16］。此外，替普瑞酮還能夠激活MAPK 信號(hào)通路，MAPK 激活后能活化上皮細(xì)胞的增殖，MAPK 途徑激活也能下調(diào)P53 及Rb基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［17］。因此，作者推測替普瑞酮可能通過激活胃上皮細(xì)胞內(nèi)MAPK 信號(hào)通道以及HSP70、mTOR 等靶分子參與調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的增殖與遷移。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也發(fā)現(xiàn)替普瑞酮能夠顯著降低人胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，替普瑞酮通過抑制胃上皮細(xì)胞凋亡從而減輕胃黏膜損傷。早先的研究發(fā)現(xiàn)替普瑞酮能誘導(dǎo)熱休克蛋白（HSP）如HSP70、HSP72、HSP90高表達(dá)，而HPS是機(jī)體內(nèi)重要的抗凋亡因子［8-9］。隨著替普瑞酮能刺激HSP 的表達(dá)被證實(shí)，替普瑞酮能抑制細(xì)胞凋亡的研究越來越受到人們的關(guān)注，人們相繼證明了替普瑞酮通過激活HSP的表達(dá)，對阿爾茨海默病、心肌纖維化及藥物相關(guān)性肝腎損害等諸多疾病具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用［18-20］。替普瑞酮作為一種無毒害作用的HSP誘導(dǎo)劑，受到研究者們的青睞，但是目前具體的凋亡機(jī)制尚不明顯，對于替普瑞酮保護(hù)人胃黏膜的途徑及具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，該研究首次選用人胃黏膜上皮細(xì)胞為研究對象并成功證明了替普瑞酮能夠促進(jìn)人正常胃上皮細(xì)胞增殖及遷移，抑制人正常胃上皮細(xì)胞凋亡，從而對替普瑞酮的胃黏膜保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了初步探討，也為進(jìn)一步探討替普瑞酮對胃黏膜保護(hù)的相關(guān)信號(hào)通路和靶分子機(jī)制提供了一個(gè)更好的細(xì)胞模型。

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