FOXP1蛋白在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及預(yù)后意義＊

張亞楠，劉漢鋒

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院腫瘤內(nèi)科，南寧530007）

彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是一組在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及病理特征上都具有明顯異質(zhì)性的非霍奇金淋巴瘤，此外，其異質(zhì)性還表現(xiàn)在對治療的反應(yīng)不同。叉頭框轉(zhuǎn)錄蛋白1（forkhead box protein1，F(xiàn)OXP1）是一種翼型螺旋亞結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，是FOXP亞家族FOXP1～4轉(zhuǎn)錄因子成員，廣泛表達于各種正常細胞和腫瘤組織中［1-5］。近年來，眾多研究顯示FOXP1在DLBCL中的表達與其預(yù)后相關(guān)，但研究結(jié)果尚有一定爭議［6-7］。本研究旨在探討FOXP1在DLBCL的表達情況及其與臨床病理特征和經(jīng)R-CHOP方案治療的患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2013年12月本院病理科和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科存檔的40例DLBCL石蠟標(biāo)本，取材時均未接受手術(shù)及放化療，且病理診斷結(jié)果均經(jīng)2名病理醫(yī)師確認(rèn)。其中男24 例，女16 例；年齡17～78歲，中位年齡49歲，＜60歲者31例，＞60歲者9例；TNM 分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例，Ⅳ期15例；結(jié)外侵犯者21例。確診后所有病例均采用R-CHOP 方案（美羅華375 mg／m2靜脈滴注，第1天；環(huán)磷酰胺750mg／m2靜脈滴注，第1天；表柔比星50mg／m2靜滴，第1天；長春新堿1.4mg／m2靜滴，第1天；潑尼松100mg口服，第1～5天），21d為一個周期，化療6～8個周期。另以40例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織作為對照。

1.2 隨訪 自確診之日起，全部病例采用門診復(fù)查或電話隨訪進行數(shù)據(jù)收集。隨訪截止時間為2014年4月30日，其中2例失訪而不具備完整資料，隨訪率為95%，失訪病例以失訪日期作為死亡日期。隨訪過程中患者死于其他疾病或意外、未能隨訪到患者或其家屬、在隨訪截止日期尚生存的患者為截尾數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學(xué)上按刪失計算。

1.3 免疫組織化學(xué)Envision法 常規(guī)石蠟切片（4μm ）、脫蠟、水化后置于EDTA（pH9.0）中，高壓鍋進行高溫高壓抗原修復(fù)3min，冷卻后用PBS沖洗3min×3，再將3%過氧化氫滴于組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，常溫15min后PBS沖洗3min×3，滴加一抗4 ℃孵育過夜；取出后置于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫45min，PBS沖洗5min×3，滴加二抗37 ℃孵育30min，PBS沖洗5min×3；DAB 顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木素襯染。以0.01mmol／L PBS代替一抗作陰性對照。濃縮型兔抗人FOXP1單克隆抗體（稀釋度1∶300）購自美國Epitomics公司；鼠抗人CD10、Bcl-6和MUM-1單克隆抗體（不需稀釋）、二抗試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4 結(jié)果判定 陽性染色均為棕黃或棕褐色。FOXP1定位于細胞核，染色結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)為：0 級，＜10%腫瘤細胞核染色；1級，10%～30%腫瘤細胞核染色；2級，31%～50%腫瘤細胞核染色；3級，＞50%腫瘤細胞核染色。評分0和1級判定為陰性（0～30%），2 和3 級判定為陽性（＞30%）［8］。MUM-1、BCL-6定位于細胞核，CD10定位于細胞膜，結(jié)果判定均為：陽性細胞大于30%計為陽性（＋），陽性細胞小于30%計為陰性（-）［9］。根據(jù)CD10、MUM-1和BCL-6將DLBCL分為生發(fā)中心型（germinal center B cell like，GCB）和非生發(fā)中心型（non-germinal center B cell like，non-GCB）兩種類型，其中CD10（＋）或（-）、BCL-6（＋）、MUM-1（-）為GCB 型，CD10（-）、BCL-6（＋）、MUM-1（＋），CD10（-）、BCL-6（-）、MUM-1（＋）或（-）為non-GCB型［9］。完全緩解（CR）是指所有的瘤塊以及腫瘤的臨床表現(xiàn)完全消失且持續(xù)至少1個月；無病生存期（PFS）指從確診到疾病進展或死亡的時間；總生存期（OS）指從確診到死亡或末次隨訪之間的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用率表示，比較用χ2檢驗法，生存曲線用Log-Rank檢驗，生存分析用Kaplan-Meier法，多因素分析采用COX風(fēng)險比例模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXP1在DLBCL 中的表達 FOXP1主要定位于細胞核，40 例DLBCL 組織中FOXP1陽性表達率為50.0%（20／40），見圖1；根據(jù)CD10、MUM-1和BCL-6 3個指標(biāo)的表達情況分類，14例為GCB型，26例為non-GCB型，其中GCB 型FOXP1的陽性表達率為14.3%（2／14），non-GCB 型FOXP1的陽性表達率為69.2%（18／26），差異有統(tǒng) 計學(xué)意義（χ2＝10.898，P＝0.01），可見FOXP1主要表達在non-GCB型DLBCL中。另40例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織的FOXP1陽性表達率為17.5%（7／40），與DLBCL 組絹比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝9.488，P＝0.002），見圖1。

圖1 FOXP1在DLBCL中的表達（免Envision法染×400）

表1 FOXP1在DLBCL中的表達與臨床病理 特征的關(guān)系［n（%）］

2.2 FOXP1在DLBCL 中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 FOXP1在DLBCL中的表達與乳酸脫氫酶（LDH）水平、B 癥狀、國際預(yù)后指數(shù)（IPI）評分、病理分型相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、臨床分期、體力狀況評分（PS）、結(jié)外侵犯及Ki-67無關(guān)（P＞0.05），見表1。

2.3 FOXP1的表達與DLBCL的預(yù)后關(guān)系 40例DLBCL 患者的CR 為47.5%，2年P(guān)FS 為52.5%，2年OS 為82.5%。GCB型DLBCL的2年P(guān)FS明顯優(yōu)于non-GCB（χ2＝4.579，P＝0.032），而GCB與non-GCB的CR 與OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Kaplan-Meier分析顯示FOXP1陽性表達者的生存期較陰性表達者短。FOXP1陽性表達者的中位無病生存期（PFS）和總生存期（OS）分別為19個月和28個月，而陰性表達者的PFS 和OS則分別為30個月和37個月，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.900，P＝0.048；χ2＝4.653，P＝0.031）。單因素相關(guān)分析顯示，臨床分期、IPI評分、病理分型及FOXP1 的表達對患者的PFS和OS有顯著影響（P＜0.05）；進一步將臨床分期、IPI評分、病理分型及FOXP1 的表達納入COX風(fēng)險比例模型，結(jié)果表明臨床分期［（RR＝1.103，95%CI：0.002～2.740，P＝0.001），（RR＝0.984，95%CI：0.019～2.666，P＝0.002）］和FOXP1 的 表 達［（RR＝0.315，95%CI：0.035～0.965，P＝0.042），（RR＝0.385，95%CI：0.119～0.834，P＝0.020）］是PFS和OS獨立的預(yù)測因素，見圖2。

圖2 FOXP1表達與PFS、OS的關(guān)系

3 討 論

DLBCL是成人中最常見的非霍奇金淋巴瘤，在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及免疫表型上都有明顯的異質(zhì)性，至今仍未確立明確的預(yù)后分子標(biāo)記物和分子模型。近年來盡管在傳統(tǒng)的以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的CHOP方案中增加利妥昔單抗的應(yīng)用使DLBCL 患者的預(yù)后得到明顯的改善［10］，但仍有部分患者難以CR 或復(fù)發(fā)后治療效果有限，這就需要找到更加準(zhǔn)確的治療靶點和預(yù)后標(biāo)記物，從而進一步的提高DLBCL患者的療效和改善預(yù)后。

FOXP1蛋白是一種由677個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為75×103的翼型螺旋轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于FOXP亞家族。在B細胞的不同分化階段的均有表達，但不表達于漿細胞，與B細胞發(fā)育和成熟、胚胎正常發(fā)育、心肌細胞發(fā)育、人類和禽類言語形成及運動神經(jīng)元多樣性和連接性相關(guān)［11-14］。研究顯示，F(xiàn)OXP1蛋白的表達與DLBCL 患者的預(yù)后相關(guān)，F(xiàn)OXP1表達失調(diào)在DLBCL的發(fā)病機制中可能起著重要作用［14］。也有研究認(rèn)為FOXP1的表達與DLBCL患者的預(yù)后無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1 在40 例DLBCL 組織中的陽性表達率為50.0%，高于國外文獻結(jié)果（18%～40%），其中，non-GCB 型DLBCL陽性表達率為69.2%。FOXP1主要表達于non-GCB型DLBCL，與國內(nèi)外多數(shù)研究結(jié)果相同［7，15］，但其表達的百分?jǐn)?shù)卻與其他研究結(jié)果一樣參差不齊，造成這些差異的原因可能是準(zhǔn)備組織的方法不同，或是樣本自身差異所致，也可能是由于FOXP1表達陽性的評價標(biāo)準(zhǔn)不同。40例DLBCL患者2年P(guān)FS為52.5%，2年OS為82.5%，均優(yōu)于胡成如等［15］對85例經(jīng)CHOP方案治療的DLBCL患者研究的生存期（2年P(guān)FS為46.5%，2年OS為68.8%），這可能與R-CHOP方案療效優(yōu)于CHOP方案有關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示FOXP1 陽性表達者的預(yù)后差于陰性表達者，F(xiàn)OXP1陽性提示預(yù)后不良。多因素回歸分析顯示，臨床分期和FOXP1 的表達是DLBCL 的PFS和OS的獨立預(yù)測因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1主要表達于non-GCB 型DLBCL，且FOXP1的表達與DLBCL的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為其預(yù)后標(biāo)記物，提示預(yù)后不良。這意味著可以針對性的以FOXP1蛋白作為靶點進行進一步研究，為治療DLBCL 開辟新的治療方法和思路，從而有望進一步提高患者的療效和改善其預(yù)后。

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