人SPOP真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其在胃癌細胞中的表達＊

曾春艷，羅時文

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.腫瘤科；2.科研中心，南昌330006）

SPOP（speckle-type POZ protein）為一種具有特異性的泛素化E3連接酶，同樣也是一個重要的腫瘤抑制蛋白［1］。在腫瘤細胞和小鼠動物試驗中都表現(xiàn)出了顯著抑制腫瘤生長和擴散的功能，研究發(fā)現(xiàn)SPOP作為泛素連接酶是通過泛素化和降解惡性腫瘤蛋白SRC-3／AIB1在腫瘤中的水平，從而起到抑制腫瘤的功能［2］。SPOP蛋白主要由374個氨基酸殘基組成，含有3 個結(jié)構(gòu)區(qū)，N 端結(jié)合底物的MATH 結(jié)構(gòu)（氨基酸殘基28～166位）；中間結(jié)合Cul的BTB 結(jié)構(gòu)（氨基酸殘基190～297位）及C端主要的其核定位／移位所需的序列（氨基酸殘基365～374位）［3］。本研究將運用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建SPOP真核表達質(zhì)粒（PUB6／V5-HisB-SPOP）并將其轉(zhuǎn)染入人胃癌AGS細胞系中，利用殺稻瘟菌素篩選，從而獲得穩(wěn)定表達SPOP蛋白的AGS細胞系，為進一步研究SPOP基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌AGS細胞株購于中科院上海細胞研究中心；空載質(zhì)粒pUB6／V5-HisB、殺稻瘟菌素、總RNA 提取液（Trizol）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒及脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑盒為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；DNA marker、cDNA 文庫（human brain）、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ，NotⅠ酶均為NEB公司產(chǎn)品；兔抗人SPOP抗體為Proteintech公司產(chǎn)品；鼠抗人β-actin抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；SPOP引物合成由美國Invitrogen公司完成；基因鑒定測序由北京諾賽基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 檢測胃癌細胞系SPOP表達，確定胃癌細胞株 檢測胃癌細胞株AGS，SGC-7901，MKN-28，MKN-45 及一株正常永生化胃黏膜上皮細胞株GES-1中SPOP的表達情況，Western blot結(jié)果顯示SPOP蛋白在5株細胞株中表達，SPOP蛋白在胃癌細胞系A(chǔ)GS 中表達最低，為后續(xù)實驗選擇細胞系做準(zhǔn)備。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank查詢?nèi)薙POP 的cDNA 序列（NM＿001007226），全長1 125bp，設(shè)計引物序列如下：正向5′-GCG CGG TAC CAT GTC AAG GGT TCC AAG TCC TCC AC-3′，反 向5′-GCG CGC GGC CGC CGG ATT GCT TCA GGC GTT T-3′，含酶切位點KpnⅠ，NotⅠ。

1.2.3 人SPOP真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 先利用人腦cDNA 文庫PCR 獲得SPOP全長片段（1 125bp），獲得目的帶進行膠回收純化。將pUB6／V5-HisB 載體及膠回收并純化的SPOP PCR 產(chǎn)物分別進行雙酶切，置于37 ℃孵育箱1h。酶切產(chǎn)物PCR 電泳，目的條帶進行膠回收純化。最后pUB6／V5-HisB質(zhì)粒加入Elution Buffer溶解，SPOP 產(chǎn)物加入12μL Elution Buffer溶解，利用分光光度計檢測質(zhì)粒濃度，將上述膠回收酶切產(chǎn)物進行連接反應(yīng)，4 ℃冰箱連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL-blue，37 ℃培養(yǎng)12～16h。觀察是否長斑，挑菌落進行質(zhì)粒驗證并測序。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)表達SPOP 細胞系的構(gòu)建

1.2.4.1 篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的殺稻瘟菌素最適合的濃度 將AGS細胞傳至6孔板生長，細胞生長至80%左右時，在培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度殺稻瘟菌素（0、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0 μg／mL）；隔日更換含相應(yīng)濃度的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基1次，對該抗生素敏感的細胞會變圓并漂浮起來；定期進行細胞計數(shù)以確定殺稻瘟菌素的最佳濃度，也可選擇在14d時造成細胞全部死亡的濃度。

1.2.4.2 PUB6／V5-HisB-SPOP質(zhì)粒的處理首先，擴增PUB6／V5-HisB-SPOP質(zhì)粒提取。紫外分光光度計測定質(zhì)粒純度和濃度。其次，線性化重組質(zhì)粒：EP管中加入PUB6／V5-HisB-SPOP質(zhì)粒200μL，SspⅠ5μL，Green Buffer 10μL后放入37℃孵箱過夜。線性化后瓊脂糖凝膠電泳，回收，用滅菌水洗脫。

1.2.4.3 PUB6／V5-HisB-SPOP 表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染AGS細胞 轉(zhuǎn)染前1天將AGS細胞于3×105／孔接種于6孔板，使次日細胞匯合達80%～90%，分為SPOP轉(zhuǎn)染組、空白對照組及空載體組；轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)基，配制溶液1：240μL 無血清培養(yǎng)基＋10μL Lipofectamine 2000，室溫放置5 min；配制溶液2：無血清培養(yǎng)基＋2μg質(zhì)粒，共250μL；將溶液1和2輕輕吹打混勻后，室溫孵育20min；將6孔板中的細胞用無血清培養(yǎng)基輕輕沖洗2遍，將混合的液體緩慢滴入6孔板中，輕輕搖動培養(yǎng)板，前后左右混勻，置37 ℃、5% CO2孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)，6h后更換含有血清的DMEM 培養(yǎng)基；更換培養(yǎng)基后24h進行殺稻瘟菌素篩選。

1.2.4.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 首先決定殺稻瘟菌素殺死轉(zhuǎn)染的宿主細胞的最小濃度。經(jīng)過濃度的篩選驗證，本實驗選擇殺稻瘟菌素7.5μg／mL的濃度。轉(zhuǎn)染后24h，消化細胞，按1∶10的比例傳代接種，待細胞貼壁后加入含殺稻瘟菌素（7.5μg／mL）培養(yǎng)基中，以后每2天換液1次，直至倒置顯微鏡下觀察細胞島的形成（即見抗性克隆形成）。待細胞島長至足夠大時挑取細胞島，轉(zhuǎn)移到24孔板常規(guī)培養(yǎng)，待24孔板中細胞長滿至80%～90%后，擴增至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，再逐步轉(zhuǎn)至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。蛋白免疫印跡法（Western blot）驗證細胞SPOP 的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s描述，進行Student′st檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PUB6／V5-HisB-SPOP重組質(zhì)粒的酶切鑒定 經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，PUB6／V5-HisB-SPOP重組質(zhì)粒在1%瓊脂糖電泳后，出現(xiàn)兩個片段，分別在5.5kb（pUB6／V5-HisB 載體）和1.1kb（SPOP）左右位置（紅色箭頭所指），見圖1。重組質(zhì)粒PUB6／V5-HisB-SPOP 由上海諾賽基因公司測序后經(jīng)NCBI 基 因BLAST 比 對，與GenBank 中 人SPOP（NM＿001007226）的核苷酸序列完全一致。

2.2 SPOP表達載體構(gòu)建驗證 PUB6／V5-HisB-SPOP測序正確后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌AGS 細胞株，殺稻瘟菌素篩選后，Western blot檢測SPOP表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組SPOP 的表達水平顯著高于空白對照組和空載體對照組（以空白對照對照組為1，轉(zhuǎn)染2、3組分別升高2.3，3.8倍），P＜0.05，驗證了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達SPOP細胞系構(gòu)建成功，見圖2。

圖1 SPOP-V5／His酶切電泳

圖2 Western blot驗證檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

3 討 論

胃癌是全世界發(fā)病率和病死率均非常高的惡性腫瘤，全球近半數(shù)胃癌發(fā)生在我國，并且近年來發(fā)病呈年輕化的趨勢［4］。研究表明胃癌與Hh／Gli信號通路的異常激活可能有關(guān)［5-7］，但其具體的分子機制目前尚不清楚。存在SHh 配體時，Hedgehog配體的作用是將Gli分子從轉(zhuǎn)錄抑制因子變成激活因子［8-10］。Gli蛋白是Hh／Gli信號通路的終端效應(yīng)因子，有研究認為有時Gli3也可表現(xiàn)為激活該信號通路的活性，但更多認為Gli2是Hedgehog信號通路激活的初級信號，并起著將激活信號放大并傳遞至Gli1（二級激活信號）的作用［11］。正常情況下，SuFu和SPOP通過競爭結(jié)合Gli2及Gli3，使其量保持一定的濃度［12-14］。SPOP蛋白是一個泛素化連接酶，介導(dǎo)Gli2及Gli3全長蛋白的降解。該基因位于人染色體17q21位點，在腫瘤細胞中具有高缺失率及雜合性丟失（LOH）現(xiàn)象。在腫瘤細胞和小鼠動物實驗中都表現(xiàn)出了顯著抑制腫瘤生長和擴散的功能，研究發(fā)現(xiàn)SPOP作為泛素連接酶是通過泛素化和降解惡性腫瘤蛋白SRC-3／AIB1在腫瘤中的水平，從而起到抑制腫瘤的功能［2］，SRC-3／AIB1同樣也是一個重要的腫瘤抑制蛋白，其有望成為腎癌等腫瘤診斷一個重要指標(biāo)［1］。SPOP 可以抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖與侵襲，并與膠質(zhì)瘤的預(yù)后相關(guān)［15］，在前列腺癌中有較高的突變率［16］。SPOP作為一個抑癌基因，是否可以通過促進Gli2蛋白全長降解或抑制Gli2全長蛋白的入核，從而使得Hh／Gli信號通路受到抑制？

為了研究SPOP是否通過介導(dǎo)Hh／Gli信號通路參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，本研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建SPOP表達質(zhì)粒PUB6／V5-HisB-SPOP，并將其轉(zhuǎn)入靶細胞胃癌AGS 細胞系，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達SPOP的細胞模型以便研究SPOP在胃癌細胞中的功能。

本研究中表達質(zhì)粒采用的載體是pUB6／V5-HisB，選擇酶切位點KpnⅠ和NotⅠ，先PCR 法獲得SPOP基因全長，雙酶切接入載體，成功構(gòu)建表達質(zhì)粒PUB6／V5-HisB-SPOP。為了構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)表達SPOP 的胃癌細胞系，將表達質(zhì)粒PUB6／V5-HisB-SPOP轉(zhuǎn)染入胃癌細胞系A(chǔ)GS，根據(jù)pUB6／V5-HisB 載體上有BSD 耐受基因，作者選擇殺稻瘟菌素進行反復(fù)篩選，以便得到穩(wěn)定表達SPOP的同源細胞系，用于后續(xù)觀察。

總之，本研究成功構(gòu)建PUB6／V5-HisB-SPOP 表達質(zhì)粒，并成功篩選出穩(wěn)定表達外源性人SPOP基因的胃癌AGS細胞系，為進一步研究SPOP對胃癌細胞生物學(xué)行為實驗研究及為胃癌發(fā)生發(fā)展的研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ Liu J，Ghanim M，Xue L，et al.Analysis of drosophila segmentation network identifies a JNK pathway factor overexpressed in kidney cancer［J］.Science，2009，323（5918）：1218-1222.

［2］ Li C，Ao J，F(xiàn)u J，et al.Tumor-suppressor role for the SPOP ubiquitin ligase in signal-dependent proteolysis of the oncogenic co-activator SRC-3／AIB1［J］.Oncogene，2011，30（42）：4350-4364.

［3］ Zhuang M，Calabrese MF，Liu J，et al.Structures of SPOPSubstrate complexes：insights into molecular architectures of BTB-Cul3ubiquitin ligases［J］.Mol Cell，2009，36（1）：39-50.

［4］ Han ME，Lee YS，Baek SY，et al.Hedgehog signaling regulates the survival of gastric cancer cells by regulating the expression of Bcl-2［J］.Int J Mol Sci，2009，10（7）：3033-3043.

［5］ Shiotani A，Kamada T，Yamanaka Y，et al.Sonic hedgehog and CDX2expression in the stomach［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23（2）：S161-166.

［6］ Wan J，Zhou J，Zhao H，et al.Sonic hedgehog pathway contributes to gastric cancer cell growth and proliferation［J］.Biores Open Access，2014，3（2）：53-59.

［7］ Yan RW，Peng X，Yuan XG，et al.Suppression of growth and migration by blocking the hedgehog signaling pathway in gastric cancer cells［J］.Cell Oncol（Dordr），2013，36（5）：421-435.

［8］ Eaton S.Multiple roles for lipids in the Hedgehog signalling pathway［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9C（6）：437-445.

［9］ Wang Y，Mcmahon AP，Allen BL.Shifting paradigms in Hedgehog signaling［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）：159-165.

［10］ Wilson CW，Chuang PT.New"hogs"in hedgehog transport and signal reception［J］.Cell，2006，125（3）：435-438.

［11］ Ruizi Altaba A，Mas C，Stecca B.The Gli code：an information nexus regulating cell fate，stemness and cancer［J］.Trends Cell Biol，2007，17（9）：438-447.

［12］ Chen MH，Wilson CW，Li YJ，et al.Cilium-independent regulation of Gli protein function by Sufu in Hedgehog signaling is evolutionarily conserved［J］.Genes Dev，2009，23（16）：1910-1928.

［13］ Wang C，Pan Y，Wang B.Suppressor of fused and Spop regulate the stability，processing and function of Gli2and Gli3full-length activators but not their repressors［J］.Development，2010，137（12）：2001-2009.

［14］ Ruel L，Thérond PP.Variations in Hedgehog signaling：divergence and perpetuation in Sufu regulation of Glii［J］.Genes Dev，2009，23（16）：1843-1848.

［15］ Ding D，Song T，Jun W，et al.Decreased expression of the SPOP gene is associated with poor prognosis in glioma［J］.Int J Oncol，2015，46（1）：333-341.

［16］ Garcia-Flores M，Casanova-Salas I，Rubio-Briones J，et al.Clinico-pathological significance of the molecular alterations of the SPOP gene in prostate cancer［J］.Eur J Cancer，2014，50（17）：2994-3002.