內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激在百草枯致大鼠肺纖維化中的作用＊

彭禮波，董瑤瑤，張志堅

（重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 401320）

研究表明，氧化應(yīng)激、ATP耗竭及細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是百草枯（paraquat，PQ）中毒后臟器損傷的主要機制之一，也是常見的誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的因素［1-3］。適度的ERS有利于組織細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持細(xì)胞正常生理功能，但持續(xù)或過強的ERS則會導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷［4］。PQ 進(jìn)入細(xì)胞后會引起強烈的氧化應(yīng)激，因此認(rèn)為PQ 可能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)ERS而在肺纖維化形成環(huán)節(jié)中發(fā)揮一定的作用。本研究旨在探討ERS在PQ 中毒后肺纖維化形成中的作用，為PQ 中毒后肺纖維治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 20%百草枯溶液由上海先正達(dá)公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）及考馬斯亮藍(lán)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠多克隆葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)78（glucose regulating protein 78，GRP78）抗體、免疫組織化學(xué)SABC 試劑盒及DAB顯色劑均購于武漢博士德公司。

1.2 百草枯誘導(dǎo)肺損傷模型的建立及動物分組 40只清潔級sprague-dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（220±40）g，雌雄各半。將實驗動物按隨機數(shù)字表法分組。對照組（n＝8）：給予生理鹽水1mL一次性灌胃；PQ 染毒組（n＝32）：將20%PQ 溶液按50mg／kg用生理鹽水稀釋，給予1mL一次性灌胃建立中毒模型，灌胃后按不同時間分為4個亞組，每組8只大鼠。染毒組分別于灌胃后1、7、14、21d腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉，腹主動脈放血處死，取肺組織進(jìn)行相應(yīng)處理后備用；對照組于21d作同樣處理。

1.3 肺組織標(biāo)本采集 按預(yù)定時間點處死動物。分離主支氣管并向下剝離后取出全肺，無菌生理鹽水沖洗，濾紙吸干。取右肺中葉10%中性甲醛溶液固定48h后轉(zhuǎn)移至0.1 mol／L PBS溶液中保存，待行肺組織病理學(xué)形態(tài)及免疫組織化學(xué)檢測。左肺中葉取下后-80 ℃保存，待測SOD 及MDA。

1.4 肺組織GRP78蛋白免疫組織化學(xué)檢測 常規(guī)切片脫蠟水化，3%H2O2處理，微波修復(fù)抗原，滴加兔抗大鼠GRP78多克隆抗體（濃度5%），4 ℃過夜后加生物素化羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC 工作液，DAB 顯色，蘇木素染色。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。每個樣本隨機抽取5個視野高倍鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)黃染的細(xì)胞作為GRP78陽性表達(dá)的細(xì)胞，計算出陽性表達(dá)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。陽性細(xì)胞百分率＝（陽性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.5 肺組織MDA 水平及SOD 活性檢測 肺組織MDA 水平及SOD 活性測定按試劑盒說明書采用比色法進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差法，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織MDA 水平及SOD 活性變化 與對照組比較，染毒組MDA 水平隨時間推移逐漸增加，各時間點均明顯高于對照組（均P＜0.05）。而SOD 活性較對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

2.2 肺組織GRP78蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果及半定量分析 與對照組比較，染毒組1d 肺組織GRP78 表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）。染毒后7d達(dá)高峰，14d明顯下降，21d時與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 不同時間點大鼠肺組織內(nèi)MDA、SOD 及GRP78 蛋白表達(dá)變化比較（±s，n＝8）

表1 不同時間點大鼠肺組織內(nèi)MDA、SOD 及GRP78 蛋白表達(dá)變化比較（±s，n＝8）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對照組比較。

組別 MDA（nmol／mg） SOD（U／mg）GRP78對照組0.81±0.04 95.52±10.12 3.18±1.02染毒組1d 1.51±0.12a 78.14±9.52a 14.25±6.36b染毒組7d 2.03±0.19b 65.22±7.28b 12.78±6.01b染毒組14d 2.99±0.22b 41.85±5.11b 6.85±4.23a染毒組21d 3.81±0.28b 30.81±3.02b 4.46±0.99

圖1 兩組大鼠肺組織GRP78表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×400）

2.3 肺組織形態(tài)學(xué)變色 HE 染色光鏡下對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔正常，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤。染毒組21d肺組織內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重時出現(xiàn)彌漫性肺出血。見圖2A、B。Masson染色見對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，染毒組21d可見藍(lán)染的膠原纖維，隨時間延長，藍(lán)染膠原纖維逐漸增多。見圖2C、D。

圖2 肺組織病理切片（×200）

3 討 論

大量基礎(chǔ)研究表明氧化應(yīng)激是肺纖維化的重要發(fā)病機制之一，特別在PQ 中毒中該機制占有更加重要的作用，因此減輕PQ 中毒后氧化應(yīng)激、糾正機體氧化-抗氧化失衡可明顯減輕肺纖維化程度［5-8］。SOD 是機體內(nèi)最主要的氧自由基清除酶，測定其活力可反應(yīng)機體自由基清除能力；MDA 則是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，測定其含量可反映機體組織細(xì)胞氧化損傷的程度，對上述指標(biāo)的聯(lián)合檢測能評價組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。本研究中發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠肺組織MDA 較對照組明顯升高，而SOD 則明顯降低，病理切片提示肺組織受損程度隨時間推移逐漸加重，說明氧化應(yīng)激在PQ 中毒肺損傷中占重要地位。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細(xì)胞重要的Ca2＋貯存器，也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配、參與脂質(zhì)代謝和類固醇激素合成的重要場所。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能通過減少蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶以及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，增加未折疊蛋白質(zhì)降解等途徑力圖使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，這些變化統(tǒng)稱ERS［9-10］。GRP78 是廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，其主要功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、裝配及運輸。當(dāng)應(yīng)激因素導(dǎo)致ERS 發(fā)生后，GRP78 合成顯著增加，因此又稱其為ERS發(fā)生的標(biāo)志性蛋白［11］。越來越多的研究表明ERS參與了很多中毒相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，如有機磷農(nóng)藥、重金屬、乙醇及某些藥物等［12-15］。近年研究表明氧化應(yīng)激是ERS的重要誘因，ROS是觸發(fā)ERS介導(dǎo)凋亡通路的上游因子。本研究結(jié)果表明染毒組大鼠肺組織中ERS標(biāo)志性蛋白GRP78表達(dá)顯著增加，隨時間延長而逐漸增加。結(jié)果表明PQ中毒導(dǎo)致肺纖維化中除了氧化應(yīng)激作用外，還有ERS參與，其機制可能是PQ 進(jìn)入細(xì)胞后激活ROS級聯(lián)反應(yīng)，機體釋放大量ROS，從而誘發(fā)ERS發(fā)生。但其具體機制尚需進(jìn)一步研究。

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