硫酸右旋糖酐抑制人胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移及其對缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響＊

王紅紅，王 娟，金 秀，徐遠(yuǎn)義

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川750001）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，而腹腔種植轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后及死亡最重要的原因，因此尋找一種可以抑制其種植轉(zhuǎn)移的藥物將會極大的提高患者的生存率。硫酸右旋糖酐（dextran sulfate，DS）是一種大分子右旋糖酐，具有腹腔吸收緩慢，毒性小，來源豐富等優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，DS可以阻止B-16 黑色素瘤細(xì)胞在大網(wǎng)膜乳斑和腹膜上的種植，并可延長患有癌性腹膜炎小鼠的生存時(shí)間［1］。缺氧是實(shí)體性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一，在缺氧微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hif-1α）［2］。目前相關(guān)研究［3］表明Hif-1α與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。本研究通過免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄（RT-PCR），在前期研究的基礎(chǔ)上，檢測通過胃癌細(xì)胞BGC-823所構(gòu)建的裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移模型中Hif-1α的表達(dá)，觀察DS對胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移的作用，并探討Hif-1α在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人胃癌細(xì)胞株BGC-823購于北京金紫晶生物公司腫瘤細(xì)胞庫。BALB／c裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，雄性，體質(zhì)量18～21g，4～6周齡，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級，自由攝取無菌食物及飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 DS購自Sigma公司，生理鹽水稀釋，用22μm 過濾器過濾，使其最終濃度為0.3%；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Hif-1α多克隆抗體購自Proteintech生物有限公司（1∶200稀釋），山羊抗兔二抗、DAB 購自北京中山金橋生物科技有限公司；總mRNA 提取試劑盒購自O(shè)mega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Frementas公司；PCR 試劑盒購自北京康為試劑科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株BGC-823從液氮中取出，于37 ℃水浴鍋中快速復(fù)蘇后，培養(yǎng)于RPMI1640 完全培養(yǎng)基（含10% 滅活胎牛血清）中。在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，隔天傳代。在細(xì)胞對數(shù)生長期時(shí)收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×107／mL備用。

1.2.2 分組、動(dòng)物模型的建立 BALB／C裸鼠72只，用0.5%戊巴比妥鈉50mg／kg麻醉，腹部皮膚消毒后，于腹部劍突下切約0.5cm 長切口，暴露胃壁，于胃壁后懸浮滴入0.2mL 1×107／mL的細(xì)胞懸液，關(guān)閉切口。裸鼠分為兩組，一組32只，于第2天在切口附近注入1mL 生理鹽水，另一組40只，于第2天切口附近注入0.3% DS 1mL。每組再分為4小組，于注入藥物后的第1、3、7、14天用頸椎脫位法處死裸鼠。觀察大網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)量、大小、顏色，取大網(wǎng)膜分為兩份，一份用于制作蠟塊，另一份凍存于-80 ℃低溫冰箱中用于RT-PCR。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 組織經(jīng)10%甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋，切取0.4 mm 厚組織。免疫組織化學(xué)染色采用二步法，PBS代替一抗作為陰性對照。Hif-1α于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，觀察陽性細(xì)胞分布特點(diǎn)。應(yīng)用IPP 圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)，在400 倍鏡下，選定空白區(qū)定標(biāo)及具有代表性的5 個(gè)視野，測定光密度（OD）值進(jìn)行計(jì)算，獲得所選視野的平均光密度值。

1.2.4 RT-PCR 總mRNA 提取試劑盒提取總RNA，按試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。Hif-1α引物：正向5′-GAA AGC GCA AGT CTT CAA AG-3′，反向5′-TGG GTA GGA GAT GGA GAT GC-3′，目的片段長度為167bp，反應(yīng)條件：94 ℃3min；94 ℃30s，58 ℃30s，72 ℃30s30個(gè)循環(huán)；72 ℃4min。內(nèi)參GAPDH：正向5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′，反向5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3′，目的片段長度為496bp，反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s30個(gè)循環(huán)，72℃7min。PCR 產(chǎn)物用溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將圖像攝入Quantity One分析系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行圖像分析，以相對光密度（ROD）代表基因表達(dá)豐度，以Hif-1α／GAPDH 計(jì)算Hif-1α的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件整理分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)組及對照組腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量 結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)時(shí)以結(jié)節(jié)間界限較清楚記為各自獨(dú)立結(jié)節(jié)。隨著時(shí)間的推移，在大網(wǎng)膜、腹膜、肝脾均可見到瓷白色結(jié)節(jié)，質(zhì)略硬，腹腔瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增加，3d時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），7、14d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對照組數(shù)量明顯減少，直徑減?。≒＝0.000），見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組及對照組不同時(shí)間點(diǎn)腹腔腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組Hif-1α的表達(dá) Hif-1α于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)，1d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3、7、14d時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對照組表達(dá)明顯降低（P＜0.01），見圖2、表1。

圖2 對照組與實(shí)驗(yàn)組Hif-1α免疫組織化學(xué)表達(dá)結(jié)果（×400）

2.3 RT-PCR 法檢測不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組Hif-1αmRNA 的表達(dá) 與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Hif-1αmRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），見表2。

表1 免疫組織化學(xué)檢測對照組及實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Hif-1α的表達(dá)（±s）

表1 免疫組織化學(xué)檢測對照組及實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Hif-1α的表達(dá)（±s）

組別 1d 3d 7d 14d F P對照組 56.97±4.36 74.37±3.36 94.51±4.81 137.11±4.30 327.980 0.000實(shí) 驗(yàn) 組 53.49±2.18 67.14±3.25 82.64±3.77 87.31±4.51 95.295 0.000 t 1.577 3.456 4.338 17.881 P 0.154 0.009 0.002 0.000

表2 RT-PCR 法檢測對照組與實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Hif-1αmRNA 表達(dá)（±s）

表2 RT-PCR 法檢測對照組與實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)Hif-1αmRNA 表達(dá)（±s）

組別 1d 3d 7d 14d F P對照組 1.18±0.47 1.63±0.34 2.63±0.44 3.61±0.41 100.964 0.000實(shí) 驗(yàn) 組 0.83±0.18 1.36±0.22 1.86±0.47 1.86±0.46 27.883 0.000 t 2.672 2.584 4.625 10.988 P 0.016 0.015 0.000 0.000

3 討 論

胃癌是常見的嚴(yán)重危害人類健康、高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)占我國消化道惡性腫瘤的第一位，目前住院病例中90%以上為進(jìn)展期胃癌，即使施行根治手術(shù)，腹腔轉(zhuǎn)移仍是胃癌無法手術(shù)根治的主要原因之一，也是術(shù)后復(fù)發(fā)、治療失敗的主要原因。胃癌術(shù)后腹腔化療已作為阻止腹腔種植轉(zhuǎn)移的一種常規(guī)治療手段，普通化療藥物在腹腔容易被吸收，導(dǎo)致該藥在腹腔停留時(shí)間短不能達(dá)到很好的抗癌作用。

本實(shí)驗(yàn)研究的DS相對分子質(zhì)量大，約50×104，致使其在腹腔吸收緩慢，可在腹腔形成比較持久的高濃度，從而對腹腔腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。國外于1997年開始研究DS 的抗癌作用。曾有研究顯示，DS可以阻止B-16黑色素瘤細(xì)胞在大網(wǎng)膜乳斑及腹膜上的種植，可安全的使用于胃腸道吻合手術(shù)，所以DS被認(rèn)為是具有潛力的抗癌藥物［4］。本課題組前期研究顯示，DS在體外可抑制人胃癌細(xì)胞MKN1 的黏附及整合素β1的表達(dá)［5］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦研究顯示，DS可以抑制整合素β1的表達(dá)［6-7］及VEGF的表達(dá)［8］。

Hif-1α是1992年由Ratcliffe等［9］發(fā)現(xiàn)的一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，Hif-1主要由Hif-1α 和Hif-1β兩個(gè)亞單位組成，其中Hif-1α是惟一的氧調(diào)節(jié)亞單位，主要表達(dá)在缺氧的組織細(xì)胞內(nèi)［10］。缺氧是實(shí)體性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一，腫瘤生長到一定階段，當(dāng)氧的需求超過供給，或腫瘤內(nèi)的不成熟血管因間質(zhì)內(nèi)壓力上升而塌陷時(shí)，局部微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞在長期缺氧微環(huán)境刺激下，通過Hif-1α 表達(dá)增高調(diào)控血管新生，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑適應(yīng)缺氧微環(huán)境而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［11］。

本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DS可以減少實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔內(nèi)的胃癌結(jié)節(jié)數(shù)量并減小其體積，且可有效地降低Hif-1α mRNA 及蛋白的表達(dá)，表明DS可以抑制胃癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)的轉(zhuǎn)移生長，其可能是DS通過抑制Hif-1α的表達(dá)而發(fā)揮作用，使腫瘤局部缺氧狀態(tài)不能得到改善，從而抑制腫瘤的生長，最終抑制胃癌細(xì)胞在腹腔的轉(zhuǎn)移生長。Ardyanto等［12］用CoCl2處理不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株，結(jié)果顯示Hif-1α的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)。易楠等［13］的研究發(fā)現(xiàn)miR-18α能作用于Hif-1α的13′UTR，抑制其蛋白表達(dá)，從而最終抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DS可以減少實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔內(nèi)的胃癌結(jié)節(jié)數(shù)量并減小體積，且可有效地降低Hif-1αmRNA 及蛋白的表達(dá)。DS抑制胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是其通過下調(diào)Hif-1α的表達(dá)而發(fā)揮作用，Hif-1α在DS抑制胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，降低Hif-1α的表達(dá)對抑制胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)，DS可以抑制胃癌的腹腔種植轉(zhuǎn)移，可為胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移臨床治療提供新的藥物。

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