紅蕓豆植物凝集素終止小鼠中晚期妊娠對(duì)胎盤(pán)組織的影響研究

楊成煥 楊 姚 李 闊 王靜靜 姚婭婷 張 田 王敏康

云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心（昆明，650500）

以往的研究發(fā)現(xiàn)蕓豆植物凝集素（PHA）可抑制受精、抗著床［1－2］、影響胚胎發(fā)育并具有終止妊娠作用［3－4］。同時(shí)還具有明顯的抗人免疫缺陷病毒作用［5－6］。隨著對(duì)其各方面的深入研究，越來(lái)越多的證據(jù)顯示其在生物、醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)研究表明在終止妊娠方面，紅蕓豆PHA是通過(guò)直接與子宮和胎盤(pán)接觸而發(fā)揮作用，但其終止妊娠作用是以何種途徑實(shí)現(xiàn)尚不清楚。胎盤(pán)是連接母體與胎兒的重要器官，對(duì)妊娠的維持具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)紅蕓豆PHA導(dǎo)致流產(chǎn)的小鼠胎盤(pán)進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察、DNA提取與電泳以及胎盤(pán)與子宮8－異前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）的檢測(cè)，以了解紅蕓豆PHA在終止小鼠妊娠時(shí)對(duì)胎盤(pán)的形態(tài)和功能的影響，為研究紅蕓豆PHA終止妊娠機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅蕓豆PHA，由本實(shí)驗(yàn)室從紅蕓豆（Phaseolus vulgaris Linnaeus）中提取并進(jìn)行濃縮。用于注射的PHA含0.8%氯化鈉，使用前用PBS配制成所需的濃度。注射用血清促性腺激素（PMSG），杭州動(dòng)物藥品廠，生產(chǎn)批號(hào)：140102；注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG），杭州動(dòng)物藥品廠，生產(chǎn)批號(hào)：140214；動(dòng)物組織基因組（DNA）提取試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：CW0546；小鼠8－異前列腺素 F2α（8－iso－PGF2α）ELISA 試劑盒、甲基綠、派諾寧Y均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（TUNELPOD），上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，貨號(hào)：AP005－3；DAB顯色試劑盒，北京索萊寶科技公司，貨號(hào)：DA1010；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭GL－168高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明白小鼠，體重25～28g，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫21～25℃飼養(yǎng)，12h光照，12h黑暗，自由攝食與飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理及取材 對(duì)性成熟雌鼠進(jìn)行超排卵處理：下午6：00皮下注射PMSG，劑量為5U／只，48h后腹腔注射hCG，劑量為5U／只。然后與雄鼠按2∶1合籠，次日見(jiàn)栓者為妊娠第1天。于妊娠第14天給藥，分為PHA和PBS兩組，每組40只。再按不同時(shí)間處理段分為4個(gè)小組，每小組10只。給藥方式為非手術(shù)法經(jīng)陰道單側(cè)子宮單次注射。PHA組注射紅蕓豆PHA 5mg／只。PBS組注射PBS，0.05ml／只。分別于注射后2h、5h、8h和24h或看到流產(chǎn)現(xiàn)象時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行斷頸處死，分離子宮并除去胎鼠，取子宮段和胎盤(pán)分別勻漿，3000g離心10min，取上清用于測(cè)定8－iso－PGF2α，一部分子宮和胎盤(pán)保存于－20℃冰箱，用于DNA提取，剩余部分用中性甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.3.2 子宮、胎盤(pán)染色及DNA提取 ①子宮臺(tái)盼藍(lán)染色：分別于注射后2h、5h、8h和24h或看到流產(chǎn)現(xiàn)象時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行斷頸處死，經(jīng)子宮角注射0.5%臺(tái)盼藍(lán)，使子宮充滿，10min后分離子宮并用PBS洗去多余臺(tái)盼藍(lán)，去除胎兒，保留子宮和胎盤(pán)部分觀察。②孕鼠子宮及胎盤(pán)核酸電泳：?。?0℃保存的孕鼠子宮及胎盤(pán)按動(dòng)物組織基因組（DNA）提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳［7］。③子宮及胎盤(pán)甲基綠－派諾寧染色：取固定的孕鼠子宮和胎盤(pán)于48h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋和切片、甲基綠－派諾寧染色（5%派諾寧、2%甲基綠）、脫水、封片并顯微鏡觀察。④ 胎盤(pán)的TUNEL檢測(cè)：取固定的子宮與胎盤(pán)于48h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋和切片、并按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL顯色和鏡檢。

1.3.3 子宮及胎盤(pán)8－iso－PGF2α測(cè)定 勻漿離心后的上清液按小鼠8－iso－PGF2αElisa試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行洗板、孵育等操作。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出孕鼠各個(gè)時(shí)間段的8－iso－PGF2α值。用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS11.5分別對(duì)孕鼠子宮和胎盤(pán)勻漿的8－iso－PGF2α進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent Samphes Test）分析。

2 結(jié)果

2.1 妊娠結(jié)局

PBS組孕鼠無(wú)明顯異常行為表現(xiàn)，而PHA組孕鼠則出現(xiàn)腹部收縮以及輕微毛發(fā)蓬松現(xiàn)象，在注射紅蕓豆PHA 7.5～9.5h后孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。解剖觀察表明，PBS組孕鼠子宮及胚胎均正常，而注射紅蕓豆PHA組孕鼠子宮系膜和胎盤(pán)充血明顯（圖1）；注射紅蕓豆PHA后8h及出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象時(shí)，還伴有胎鼠與胎盤(pán)脫落或易與胎盤(pán)分離、胎盤(pán)與PBS組胎盤(pán)相比明顯變薄且易與子宮分離。

圖1 小鼠胎盤(pán)充血情況直觀圖

2.2 染色結(jié)果

臺(tái)盼藍(lán)染色后肉眼觀察可見(jiàn)PHA組胎盤(pán)顏色較PBS組深，且子宮一側(cè)靠近邊緣處出現(xiàn)一圈深色染色區(qū)域（圖2），解剖鏡下可見(jiàn)此處顏色加深呈藍(lán)色。解剖鏡下亦可見(jiàn)PBS組與PHA組胎盤(pán)邊緣、子宮以及羊膜均有臺(tái)盼藍(lán)染色。但PHA組胎盤(pán)在近子宮一側(cè)的邊緣附近一圈染色是PBS組所沒(méi)有的。甲基綠－派諾寧染色（圖3）則顯示出：與PBS組相比，PHA組切片顏色紅色較多，綠色較少，且隨著時(shí)間推移，對(duì)比越明顯。圖3D、3F、3H較3A、3B、3C、3E、3G 顏色偏紫紅，說(shuō)明注射PHA 后5h、8h及孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象時(shí)細(xì)胞凋亡較明顯。

圖2 小鼠胎盤(pán)臺(tái)盼藍(lán)染色直觀圖（200×）

圖3 甲基綠－派諾寧染色效果圖（400×）

2.3 TUNEL檢測(cè)結(jié)果

固定后的胎盤(pán)經(jīng)DAB顯色后鏡檢可看到細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象（DAB顯色后呈棕色）。注射PHA 5h后胎盤(pán)細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象明顯高于PBS組（圖4、圖5），且在5h時(shí)細(xì)胞凋亡主要存在于胎盤(pán)近子宮側(cè)。

2.4 電泳結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PBS組和PHA組胎盤(pán)DNA存在差異：PBS組電泳條帶單一，只有唯一一條條帶，而且條帶相對(duì)整齊，而PHA組條帶存在明顯的拖尾現(xiàn)象（圖6A）。子宮DNA電泳兩組無(wú)明顯差異，均出現(xiàn)單一的條帶（圖6B）。

圖4 TUNEL檢測(cè)結(jié)果圖（40×）

圖5 TUNEL染色檢測(cè)結(jié)果比較（400×）

圖6 子宮和胎盤(pán)的DNA電泳圖

2.5 8－iso－PGF2α檢測(cè)結(jié)果

注射紅蕓豆PHA后2、5、8h及流產(chǎn)時(shí)，PHA組孕鼠胎盤(pán)勻漿中8－iso－PGF2α的水平和PBS組比較無(wú)差異（表1），而孕鼠子宮勻漿中8－iso－PGF2α水平在注射紅蕓豆PHA后2h、8h及流產(chǎn)時(shí)明顯低于注射PBS組（表1）。從圖7可以看出PBS組胎盤(pán)內(nèi)和子宮內(nèi)8－iso－PGF2α水平的變化趨勢(shì)是一致的，但PHA組胎盤(pán)內(nèi)和子宮內(nèi)8－iso－PGF2α水平的變化趨勢(shì)并不一致，子宮內(nèi)8－iso－PGF2α在注射PHA后到孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)時(shí)呈下降趨勢(shì)。

表1 胎盤(pán)和子宮8－iso－PGF2α含量隨時(shí)間變化情況（pg／ml）

圖7 胎盤(pán)和子宮中8－iso－PGF2α水平濃度變化情況折線圖

3 討論

胎盤(pán)承擔(dān)著母體與胎兒間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與代謝物質(zhì)交換的重任，同時(shí)胎盤(pán)還分泌許多與妊娠相關(guān)的激素，所以，胎盤(pán)功能的保持對(duì)維持妊娠是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在注射紅蕓豆PHA后孕鼠胎盤(pán)表觀出現(xiàn)淤血現(xiàn)象，胎盤(pán)部分的臺(tái)盼藍(lán)著色也表明PHA處理組導(dǎo)致胎盤(pán)組織出現(xiàn)細(xì)胞死亡。與甲基綠—派諾寧染色以及TUNEL檢測(cè)、電泳結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)比較均說(shuō)明小鼠胎盤(pán)在注射紅蕓豆PHA后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡和組織壞死。進(jìn)而，紅蕓豆PHA產(chǎn)生的凝血作用也應(yīng)該是造成胎盤(pán)喪失維持妊娠作用的一個(gè)重要原因。妊娠中期胎盤(pán)產(chǎn)生大量的孕酮［8］，胎盤(pán)受損必然導(dǎo)致其功能受影響，例如直接影響胎盤(pán)孕酮的合成和損害胎盤(pán)血液循環(huán)。這些都是導(dǎo)致妊娠終止的原因。

本實(shí)驗(yàn)中注射PHA后子宮勻漿8－iso－PGF2α水平明顯下降，與引產(chǎn)［9］和自然分娩［10］的子宮中，PGF2α顯著升高的結(jié)論不太一致，其原因可能有兩點(diǎn)。其一，文獻(xiàn)［9－10］中測(cè)定的是子宮腔內(nèi)液的PGF2α水平，而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是子宮組織勻漿中的PGF2α水平。在分離子宮和胎盤(pán)后，均用紗布擦干表面液體，然后再勻漿處理，因此子宮勻漿PGF2α水平偏低很可能是因?yàn)樵群铣傻腜GF2α已大量釋放。其二，PGF2α的作用程序與子宮狀態(tài)和激素水平有關(guān)。子宮肌細(xì)胞上PG受體隨妊娠進(jìn)展而增加，分娩期達(dá)高峰，中晚期妊娠子宮對(duì)PG更為敏感［11－12］。PHA 組子宮勻漿 8－iso－PGF2α水平明顯下降可能與胎盤(pán)的變化有關(guān)聯(lián)，雖然檢測(cè)結(jié)果中注射PHA后胎盤(pán)勻漿8－iso－PGF2α水平升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是PHA組每個(gè)受測(cè)個(gè)體8－iso－PGF2α水平均高于PBS組。

與天花粉蛋白［13］一樣，紅蕓豆PHA在終止妊娠時(shí)，對(duì)作用部位有一定的細(xì)胞專一性。綜合以上及相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為紅蕓豆PHA終止妊娠的機(jī)制在對(duì)胎盤(pán)的專一性結(jié)合和作用方面與天花粉蛋白是類似的，即紅蕓豆PHA與胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合后，通過(guò)損傷引起細(xì)胞凋亡和副凋亡途徑，從而破壞滋養(yǎng)層細(xì)胞（特別是合體滋養(yǎng)層細(xì)胞）。通過(guò)產(chǎn)生壞死和凝血等綜合作用，進(jìn)而達(dá)到終止妊娠的作用。但也有所區(qū)別，比如其顯著的凝血作用。而且紅蕓豆PHA幾乎沒(méi)有任何天花粉表現(xiàn)出的毒副作用［14－15］。

通過(guò)廣泛深入的研究和驗(yàn)證，紅蕓豆PHA有可能發(fā)展成為一種高效，具有特異性和作用范圍更廣的新型終止妊娠藥物。

［1］ 陳蕙玲，周念輝，孫冊(cè).ConA的抗著床效應(yīng)［J］.生理學(xué)報(bào)，1988，40（2）：202～207.

［2］ 張麗芬.蕓豆植物凝集素（PHA）對(duì)小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的影響［D］.昆明：云南師范大學(xué)碩士學(xué)位研究生畢業(yè)論文，2010.

［3］ 張麗芬，王昌梅，楊明潔，等 ，蕓豆植物凝集素對(duì)小鼠體外受精的影響［J］.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2011，19（2）：81～85.

［4］ 張麗芬，王昌梅，楊明潔，等，蕓豆植物凝集素終止小鼠中晚期妊娠的研究／／中國(guó)生理學(xué)會(huì)第23屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集［C］.北京：中國(guó)生理學(xué)會(huì)，2010：4.

［5］ Oppenheimer SB，Alvarez M，Nnoli J.Carbohydrate－based experimental therapeutics for cancer，HIV／AIDS and other diseases［J］.Acta Histochem，2008，110（1）：6～13.

［6］ Sindhura BR，Vishwanath Reddy H，Inamdar SR，et al.Lectins：Magic Bullet towards HIV Gp120［J］.Antivir Antiretrovir，2012，4：101～102.

［7］ 高超，華子春.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法新進(jìn)展［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（5）：564～569.

［8］ 王淑貞，袁耀萼.婦產(chǎn)科理論與實(shí)踐［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：874.

［9］ Ciba Foundation Symposium 47（News Series）.The Fetus and Birth［M］.Elsevier Excerpta Medica North Holland Amsterdam Oxford：New York，1997，343.

［10］ Fuchs AR，Husslein P，F(xiàn)uchs F.oxytocin and the initiation of human parturition.II.Stimulation of prostaglandin production in human decidua by Oxytocin［J］.Am J Obstet Gynecol，1981，141（6）：694－697.

［11］ 石彬，王振海.前列腺素類藥物終止中期妊娠研究現(xiàn)狀［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)計(jì)劃生育分冊(cè)，2008，19（3）：150～152.

［12］ 賈瑞喆，劉曉梅.妊娠晚期子宮平滑肌與蛻膜組織中前列腺素E2與F2alpha的表達(dá)與縮宮素引產(chǎn)的關(guān)系［J］.江蘇醫(yī)藥，2009，25（5）：501～503.

［13］ 熊用周，潘平，徐紹嫣，等.天花粉蛋白對(duì)體外培養(yǎng)人胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞影響的研究［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，1976，22（2）：172～179.

［14］ 張茹，黃利鳴，岑暢飛.天花粉蛋白作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（12）：3116～3117.

［15］ 仇偉欣.天花粉藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，1996，3（6）：11～13.