酪氨酸蛋白激酶抑制劑聯(lián)合放療抑制乳腺癌細(xì)胞增殖以及荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)

楊照環(huán)，何笑冬，王 穎，李 倩，舒小鐳

（1.唐山市工人醫(yī)院腫瘤放化療科，河北唐山063000；2.重慶市腫瘤醫(yī)院乳腺科400016；3.重慶市腫瘤醫(yī)院放射治療科400016；4.重慶市腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科400016）

乳腺癌是目前危害婦女健康的主要惡性腫瘤，每年約有近120 萬婦女患上此病，且有約50 萬人死于乳腺癌，具有很高的致死率［1］。相對(duì)于北美、北歐等乳腺癌高發(fā)病區(qū)，雖然我國(guó)處于低發(fā)病區(qū)，但是該病的發(fā)病率卻呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，越來越多地影響著人類的健康［2-3］。

乳腺癌的治療主要有手術(shù)、內(nèi)分泌治療、化療、放療等手段，其中放療在腫瘤的綜合治療中具有重要的作用［4-5］。隨著設(shè)備及技術(shù)的不斷進(jìn)步，在很大程度上提高了腫瘤的局部控制率。但由于多數(shù)癌細(xì)胞本身具有的原發(fā)性輻射抵抗能力或者通過放射治療后獲得的繼發(fā)性輻射抵抗能力，成為了影響放射治療療效或者癌癥復(fù)發(fā)的重要原因，上述兩種情況一旦發(fā)生，即使給予更高劑量的輻射劑量，也很難完全消滅癌癥細(xì)胞［6-8］。

酪氨酸蛋白激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）主要以表皮生長(zhǎng)因子受體為靶點(diǎn)，通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞輻射抗性、抑制血管形成和減少癌癥細(xì)胞再增殖等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖［9］。本研究中通過研究TKI 聯(lián)合X射線放療對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用以及荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)，以期為TKI 聯(lián)合X射線放療應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 為唐山市工人醫(yī)院腫瘤放化療科保存；細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco 公司產(chǎn)品；舒尼替尼酪氨酸蛋白激酶抑制劑（TKI 的一種）為美國(guó)FDA產(chǎn)品（批號(hào)：PY595201，美國(guó)Pfizer 制藥公司）；X射線治療儀為日立公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀均為Thermo 公司產(chǎn)品；其余研究中用到的儀器及材料均為本單位自有。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出MCF-7 細(xì)胞并解凍復(fù)蘇，放入含有13%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中，置于5%CO2濃度、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞鋪滿皿底85%以上。將乳腺癌細(xì)胞分為生理鹽水組，TKI 干預(yù)組（TKI 處理后無X射線照射），X射線干預(yù)組（X射 線照射無TKI 處理）和TKI 聯(lián)合放療干預(yù)組。

1.2.2 噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)的細(xì)胞置于無血清的培養(yǎng)基DMEM／F12中，同時(shí)加不同濃度（0、50、100、150、200、250、300 nmol／L）的TKI 繼續(xù)培養(yǎng)12h 后，將細(xì)胞放到X射線治療儀中照射，然后將細(xì)胞移入不含TKI 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT液至終濃度為5 mg／μL，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入300μL 二甲基亞砜（DMSO），用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD值。每孔設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 將乳腺癌細(xì)胞消化后，經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)、稀釋，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別采用生理鹽水、TKI、X射線和TKI 聯(lián)合X射線干預(yù)，然后將細(xì)胞移入不含TKI 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d，用PBS 漂洗細(xì)胞，經(jīng)1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)，記錄大于或等于50 個(gè)克隆數(shù)的細(xì)胞，計(jì)算克隆形成率：克隆形成率＝克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%，克隆形成抑制率＝（生理鹽水組細(xì)胞克隆數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)）／對(duì)照組克隆數(shù)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 建立裸鼠移植瘤模型檢測(cè)聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用 將MCF7細(xì)胞消化后離心，將細(xì)胞沉淀重懸于新鮮的DMEM培養(yǎng)基中，然后將2 ×106 MCF-7 細(xì)胞（100μL）皮下注射接種到雌性裸鼠的背部，待腫瘤直徑達(dá)到約10 mm左右時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取建模成功的荷瘤小鼠40 只，分成4 組，分別為生理鹽水組，TKI 干預(yù)組，X射線干預(yù)組和TKI 聯(lián)合放療干預(yù)組，當(dāng)腫瘤體積生長(zhǎng)到100～200 mm3時(shí)開始給予舒尼替。給藥時(shí)采取灌胃給藥的方式，每只小鼠每次給藥0.25 mg，每2天給藥1 次并測(cè)量腫瘤大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TKI 處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 利用不同濃度（0、50、100、150、200、250、300 nmol／L）的TKI 培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞12 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示，任何濃度TKI 處理的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡，不加入TKI 培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，癌細(xì)胞凋亡率隨TKI 濃度的增加呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)M T T實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TKI 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50 和IC20 分別為113 nmol／L和34 nmol／L，因此，后續(xù)克隆形成實(shí)驗(yàn)及藥瘤祼鼠實(shí)驗(yàn)采用TKI 濃度為100 nmol／L；細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度的增加逐漸提高，TKI 濃度為50、100、150、200、250、300 nmol／L對(duì)應(yīng)的增殖抑制率分別為（11.2±1.8）%、（20.3±2.1）%、（25.7±3.2）%、（46.9±3.5）%、（69.7±5.3）%、（88.6±5.8）%；X射線照射（2 Gy）增值抑制率為（45.6±5.8）%。單獨(dú)利用X射線照射也可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。不同濃度TKI 處理可以增加乳腺癌細(xì)胞的敏感性，且呈劑量依賴性，見表1。

表1 TKI 聯(lián)合X射線對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過TKI 處理或X射線處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率都降低，細(xì)胞存活率均低于生理鹽水組（P＜0.01）。TKI 聯(lián)合放療干預(yù)組（TKI 100 nmol／L）細(xì)胞存活率最低，明顯低于其他干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組細(xì)胞克隆形成的抑制情況

2.4 各組荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況 對(duì)乳腺癌移植瘤的治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TKI 聯(lián)合放療干預(yù)組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有最強(qiáng)的抑制效果，見圖1。

圖1 各給藥組對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果

3 討 論

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著廣大女性的身心健康，隨著醫(yī)學(xué)治療技術(shù)的進(jìn)步及對(duì)癌癥發(fā)生研究的深入，人們對(duì)乳腺癌生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)觀念逐漸發(fā)生變化［10］。乳腺癌的治療也從最初單一的手術(shù)治療，發(fā)展到如今多種治療方式相結(jié)合的綜合治療，大大提高了乳腺癌治療的成功率，明顯提高了乳腺癌患者的成活率［11-12］。其中放射治療結(jié)合藥物治療方式逐漸成為乳腺癌治療手段的研究熱點(diǎn)［13］。

EGFR是含有1186個(gè)氨基酸的糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為170 ×103，具有酪氨酸激酶活性，是一種跨膜分布的細(xì)胞表面?zhèn)鞲衅鳌GFR高表達(dá)具有抑制凋亡的作用和促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管增生，因此它能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲［14］。EGFR表達(dá)異常主要表現(xiàn)為EGFR過表達(dá)和（或）突變。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在多種腫瘤中有不同程度的表達(dá)，頭頸部鱗癌中表達(dá)率為90%～100%，肺癌中表達(dá)率為40%～80%，腎癌中表達(dá)率為50%～90%，結(jié)直腸癌中表達(dá)率為25%～77%，卵巢癌中表達(dá)率為25%～70%，前列腺癌中表達(dá)率為39%～47%，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)率為40%～63%，乳腺癌中表達(dá)率為14%～90%。EGFR的過表達(dá)和（或）突變與腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡及對(duì)放療耐受等密切相關(guān)［15］。在許多腫瘤發(fā)生的過程中，EGFR家族中的ERBB-2 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加，呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，而ERBB-2 的過表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐受性，進(jìn)而降低放射治療的成功率［16］。因此，選擇以ERBB-2 為靶點(diǎn)的藥物降低腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性，并結(jié)合放射治療在理論上是一種行之有效的方法。本研究中選擇的TKI 證實(shí)利用其以EGFR 為靶點(diǎn)，通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞抗性輻射、抑制血管形成和減少癌癥細(xì)胞再增殖的特性，將TKI 處理與X射線放療相結(jié)合［17-18］，驗(yàn)證聯(lián)合處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。

研究結(jié)果顯示，只用不同濃度的TKI 處理乳腺癌細(xì)胞，也能在一定程度上抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低細(xì)胞的存活率，抑制效率與TKI 的處理濃度呈正相關(guān)。單獨(dú)用2Gy 劑量X射線照射沒有經(jīng)過TKI 處理的細(xì)胞，也能很好的抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低其存活率。但是，將TKI 處理后的細(xì)胞，再利用2 Gy 劑量X射線照射發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究采用腫瘤細(xì)胞克隆成形實(shí)驗(yàn)研究TKI 聯(lián)合X射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率的影響，結(jié)果顯示，TKI 聯(lián)合X射線能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。荷瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TKI 聯(lián)合X射線能夠有效抑制荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。

本研究初步得出TKI 處理乳腺癌細(xì)胞可能有輻射增敏作用，這可能是由于TKI 可以很好地與ERBB-2 的位點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)而阻斷了乳腺癌細(xì)胞的進(jìn)一步增殖引起的，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。本研究為TKI 在乳腺癌放療增敏作用中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為臨床中利用藥物和放療相結(jié)合的治療方式提供新的理論依據(jù)。

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