脂多糖通過TLR4-Src信號(hào)介導(dǎo)微囊胞吞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和增加血管通透性*

張 曄 張連陽 譚 浩 李 陽 孫士錦

脂多糖通過TLR4-Src信號(hào)介導(dǎo)微囊胞吞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和增加血管通透性*

張 曄 張連陽#譚 浩 李 陽 孫士錦

目的：探討脂多糖(LPS)誘導(dǎo)微囊胞吞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cad)的可能機(jī)制。方法：培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，當(dāng)其生長至融合狀態(tài)時(shí)分為正常對(duì)照組(不予再處理)、LPS處理組(采用10μg/ml LPS分別與CRL-2922再培養(yǎng)1h、2h、4h和6h)、LPS+抑制劑組包括Toll樣受體4(TLR4)抑制劑CLI-095和Src抑制劑SU6566[在LPS培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)分別加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)再培養(yǎng)4h]。采用Western Blotting法檢測(cè)各組Src蛋白表達(dá)、Cav1磷酸化和VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平；采用培養(yǎng)小室半透膜培養(yǎng)細(xì)胞，并檢測(cè)相關(guān)各組細(xì)胞熒光透過率，以反映血管通透性。結(jié)果：LPS處理不同時(shí)間組Src蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組升高(P<0.05)；與正常對(duì)照組比較，LPS處理4h組Cav1磷酸化增強(qiáng)(P<0.05)、VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)下調(diào)、Cav1與VE-Cad共沉淀水平升高(P<0.05)，單層細(xì)胞熒光透光率增加(P<0.05)；TLR4抑制劑和Src抑制劑可顯著降低LPS增高的Src蛋白高表達(dá)和Cav1高度磷酸化(P<0.05)，上調(diào)VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)Cav1與VE-Cad共沉淀水平(P<0.05)，改善單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性(P<0.05)。結(jié)論：LPS可能通過TLR4-Src信號(hào)途徑誘導(dǎo)微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

脂多糖；Toll樣受體4；Src蛋白；微囊胞吞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；血管通透性

嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥患者存在血管通透性增高，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是膿毒癥的重要啟動(dòng)因子，闡明LPS誘導(dǎo)血管通透性增高的發(fā)生機(jī)制有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究(待發(fā)表)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)膜微囊(Caveolae，簡稱微囊)介導(dǎo)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(Vascular Endothelial Cadherin，VE-Cad)胞吞是LPS致血管通透性增高的重要原因；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，微囊胞吞VE-Cad過程中，微囊重要結(jié)構(gòu)蛋白小窩蛋白(Caveolin-1，Cav1)磷酸化顯著增高。但LPS磷酸化Cav1的信號(hào)途徑目前尚不清楚。

研究表明，人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞原癌基因c-Src活化可加強(qiáng)Cav1磷酸化和微囊胞吞白蛋白和霍亂毒素B亞基[1]，而LPS可活化Src[2]，且與Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4，TLR4)有關(guān)[3]。因此推測(cè)，LPS可能通過TLR4和Src途徑磷酸化Cav1，進(jìn)而調(diào)節(jié)微囊胞吞行為，增加內(nèi)皮細(xì)胞和血管通透性。本實(shí)驗(yàn)采用LPS處理人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，通過免疫印跡法檢測(cè)其Src蛋白表達(dá)、Cav1磷酸化、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平，同時(shí)采用生物半透膜檢測(cè)單層內(nèi)皮細(xì)胞的熒光透過率，探討TLR4-Src途徑是否參與LPS誘導(dǎo)微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑和儀器

人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922購自ATCC (American Type Culture Collection)。VE-Cad抗體(批號(hào)：sc-6458)、Cav1抗體(批號(hào)：sc-894)和c-Src抗體(批號(hào)：sc-18)均購自美國Santa Cruz公司；Cav1 Tyr14位點(diǎn)磷酸化抗體(批號(hào)3251)購自美國Cell Signaling公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白(FITC-BSA)、LPS(批號(hào)L2880)和β-actin(批號(hào)A5441)均購自美國Sigma公司；質(zhì)膜蛋白提取試劑盒(批號(hào)：ab65400)購自美國Abcam公司；Src抑制劑SU6656(批號(hào)：572636)購自美國Merck公司，TLR4抑制劑CLI-095(批號(hào)：243984-11-4)購自美國Invivogen公司；DMEM-高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。培養(yǎng)小室(型號(hào)3452)購自美國Corning公司，

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：將CRL-2922細(xì)胞株加入含15%胎牛血清、4mmol/L L-谷氨酰胺、4 500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，分別用25ml培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)小室半透膜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS處理組(包括1h、2h、4h、6h亞組)和LPS+抑制劑組(包括TLR4抑制劑CLI-095和Src抑制劑SU6566)，各組n均=4。正常對(duì)照組不予再處理；LPS處理組采用LPS(10μg/ml)與培養(yǎng)細(xì)胞再培養(yǎng)不同時(shí)間；LPS+抑制劑組即在LPS培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)分別加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)共同培養(yǎng)4h。收集各組細(xì)胞，按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blotting檢測(cè)各組Src蛋白表達(dá)、Cav1磷酸化、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)，以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平，同時(shí)檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞熒光透過率(血管通透性)。

1.2.2 Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)以及Cav1與VE-Cad共沉淀水平檢測(cè)：(1)Src蛋白、Cav1磷酸化和VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)的檢測(cè)：均參照常規(guī)Western Blotting，采用8% SDS-PAGE凝膠電泳，Src抗體滴度1∶1 000，Cav1磷酸化抗體滴度1∶1 000，VE-Cad抗體滴度1∶200，β-actin抗體滴度均為1∶2 000。Quantity One軟件分析蛋白電泳條帶，以Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad與β-actin光密度比值分別表示上述蛋白表達(dá)水平。(2)Cav1和VE-Cad免疫共沉淀：在細(xì)胞裂解液中分別加入VE-Cad抗體(1∶50)和蛋白G-瓊脂糖，4℃過夜，洗滌沉淀并煮沸分離后，常規(guī)Western Blotting檢測(cè)Cav1(1∶200稀釋)表達(dá)，洗膜后檢測(cè)VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)。以Cav1/VE-Cad電泳條帶光密度值之比表示兩者共沉淀水平。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測(cè)：通過單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光透過率表示細(xì)胞通透性。取細(xì)胞融合生長的培養(yǎng)小室，在其上腔液中加入FITC-BSA作為示蹤劑，在下腔液中取樣，每隔15min一次，累計(jì)2h，檢測(cè)下腔液樣品的熒光強(qiáng)度，用累計(jì)熒光透過率表示細(xì)胞通透性[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Src蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組Src蛋白低表達(dá)(0.125±0.023)；LPS處理組Src蛋白表達(dá)均比正常對(duì)照組增高(F=5.76，P<0.05)。TLR4抑制劑組Src蛋白表達(dá)顯著低于LPS處理4h組(P<0.05)。見圖1。

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖1 LPS處理不同時(shí)間Src蛋白表達(dá)及TLR4對(duì)其的抑制

2.2 Cav1磷酸化和VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)及其兩者共沉淀水平

各組間Cav1磷酸化、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)及Cav1與VE-Cad共沉淀水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F分別為6.21、8.53、5.79，P均<0.05)。正常對(duì)照組Cav1磷酸化為0.038±0.021，VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)水平為0.608±0.085，Cav1與VE-Cad共沉淀水平為0.000±0.000。LPS處理4h組Cav1磷酸化水平較正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。與LPS處理4h組比較，Src抑制劑組和TLR4抑制劑組Cav1磷酸化水平均明顯降低(P<0.05)，VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，Cav1和VE-Cad共沉淀水平也明顯降低(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖2 各組Cav1磷酸化、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)和兩者共沉淀水平

2.3 單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性

各組間單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光透過率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.26，P<0.05)。與正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞熒光透過率(0.263±0.041)比較，LPS處理4h組顯著增高(P<0.05)； 與LPS處理4h組比較，Src抑制劑組和TLR4抑制劑組均明顯降低(P<0.05)。見圖3。

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS處理4h組比較,#P<0.05圖3 各組單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光透過率

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，微囊胞吞VE-Cad是LPS致血管通透性增高的重要原因，但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道LPS通過何種信號(hào)途徑促使內(nèi)皮細(xì)胞微囊胞吞VE-Cad。根據(jù)基礎(chǔ)研究，微囊的胞吞功能與Cav1磷酸化有關(guān)，而Src可促進(jìn)Cav1磷酸化。在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活Src可導(dǎo)致Cav1的Tyr14位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)微囊對(duì)白蛋白的胞吞，Src抑制劑PP2可以抑制Cav1的磷酸化和微囊的胞吞作用，利用基因技術(shù)使Cav1的磷酸化位點(diǎn)突變，也可阻斷c-Src激活引起的微囊對(duì)白蛋白和霍亂毒素B的胞吞作用[1,5]。LPS作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，Src的表達(dá)和活性是增高的。在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，LPS可通過結(jié)合TLR4激活Src[3]；在大鼠尾動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，LPS(100ng/ml)作用8h可導(dǎo)致Src活化[2]。提示LPS可以通過TLR4活化Src和磷酸化Cav1，使內(nèi)皮細(xì)胞微囊的胞吞功能增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理后的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，其Src蛋白表達(dá)隨LPS處理時(shí)間延長而增加，Cav1磷酸化水平較正常對(duì)照組升高，VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)較正常對(duì)照組降低；采用TLR4抑制劑和Src抑制劑干預(yù)后上述增加的Src蛋白和Cav1磷酸化顯著降低，降低的VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)則顯著上調(diào)；而且，LPS處理還能增加單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性，TLR4和Src抑制劑能使增加的通透性明顯降低。該結(jié)果與上述理論和實(shí)驗(yàn)基本一致，表明TLR4-Src信號(hào)途徑可能參與誘導(dǎo)微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

本實(shí)驗(yàn)只對(duì)LPS處理后Src總的蛋白表達(dá)進(jìn)行了觀察，未對(duì)Src磷酸化程度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)Src生物活性的評(píng)價(jià)不夠充分。另外，由于實(shí)驗(yàn)條件限制，只采用化學(xué)藥物對(duì)可能的信號(hào)途徑進(jìn)行了阻斷，未采用基因敲除方法進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將充實(shí)上述內(nèi)容，并采用免疫熒光方法檢測(cè)LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀水平，進(jìn)一步分析微囊對(duì)VE-Cad的胞吞作用。

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本文第一作者簡介：

張 曄(1979-),男，漢族，碩士，主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷后臟器功能損傷機(jī)制研究

1 Sounni NE, Paye A, Host L, et al. MT-MMPS as Regulators of vessel stability associated with angiogenesis[J]. Front Pharmacol，2011, 2: 111.

2 Kox M, Wijetunge S, Pickkers P, et al. Inhibition of Src family tyrosine kinases prevents lipopolysaccharide-induced hyporeactivity in isolated rat tail arteries[J]. Vascul Pharmacol，2007, 46(3): 195-200.

3 Gong P, Angelini DJ, Yang S, et al. TLR4 signaling is coupled to SRC family kinase activation, tyrosine phosphorylation of zonula adherens proteins, and opening of the paracellular pathway in human lung microvascular endothelia[J]. J Biol Chem，2008, 283(19): 13 437-13 449.

4 Zhao D, Qin L, Bourbon PM, et al. Orphan nuclear transcription factor TR3/Nur77 regulates microvessel permeability by targeting endothelial nitric oxide synthase and destabilizing endothelial junctions[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011, 108(29): 12 066-12 071.

5 Sverdlov M, Shinin V, Place AT, et al. Filamin A regulates caveolae internalization and trafficking in endothelial cells[J]. Mol Biol Cell，2009, 20(21):4 531-4 540.

Contribution of TLR4-Src Signal Pathway to Caveolae-mediated Endocytosis of VE-Cad after LPS Treatment

ZHANG Ye, ZHANG Lian-yang#, TAN Hao, LI Yang, SUN Shi-jin

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center of PLA, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China;#

Objective: To observe the mechanism of caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment.Method: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was cultured. It was divided into normal control group (when it grew to confluence state), LPS-treated group (using 10μg/ml LPS to incubate with the CRL-2922 for 1h, 2h, 4h and 6h); and LPS+inhibitor group[adding CLI-095 (5μg/ml) and SU6566 (2μmol/L) in the LPS cultured cells and then culturing for 4h]. Western Blotting was used to detect the Src protein expression, Cav1 phosphorylation, plasma membrane protein expression of VE-Cad, phosphorylation of Cav1 and co-precipitation levels of Cav1 and VE-Cad; semi-permeable membrane was used to culture cells, and the relevant cells fluorescence transmittance was detected to reflect vascular permeability.Results: The protein expression of Src was gradually increased after LPS treatment, as well as the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 and he monolayer cell permeability (P<0.05), and the membrane expression of VE-Cad decreased (P<0.05). The increased expression and phosphorylation could be decreased by the inhibitor of TLR4 CLI-095 and the inhibitor of Src SU6656 (P<0.05), and the inhibitors could increase the membrane expression of VE-Cad (P<0.05), and improve the monolayer cell permeability at 4h after LPS treatment (P<0.05).Conclusion: Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad was activated through LPS-TLR4-Src signal pathway.

Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Src; Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cadherin； Vascular permeability

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2012BAI11B01);軍隊(duì)“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS12J033)

第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷中心，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶400042;#

，電話：023-68757991，E-mail：hpzhangly@163.com

本文2014-12-15收到，2015-02-28修回

R605.971

A

1005-1740(2015)02-0001-04