p53表達下調(diào)對saRNA介導p21基因激活的影響研究

吳嘉 陳忠 楊為民 汪成合 蓋強強 胡嘏

·實驗研究·

p53表達下調(diào)對saRNA介導p21基因激活的影響研究

吳嘉 陳忠 楊為民 汪成合 蓋強強 胡嘏

目的研究抑制p53基因的表達是否影響小雙鏈RNA(dsRNA)分子dsP21-322對p21基因表達的激活效應。方法體外培養(yǎng)人腎癌ACHN細胞(p53野生型)和膀胱癌5637細胞(p53突變型)。采用RT-PCR方法篩選具有抑制p53基因表達的干擾RNA分子dsP53-3。人工合成具有激活效應的dsRNA分子dsP21-322，以及與人體已知RNA序列無同源性的陰性對照小dsRNA分子dsCon。將上述dsRNA分子轉(zhuǎn)染到兩種腫瘤細胞中，每種細胞均分為5組，即：①空白組；②陰性對照組；③dsP21-322單轉(zhuǎn)染組；④dsP53單轉(zhuǎn)染組；⑤dsP21-322與dsP53共轉(zhuǎn)染組。通過熒光染色檢測轉(zhuǎn)染效率，采用Real-time PCR和Western-blot技術檢測各組細胞中p53和p21轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達差異。結果①在單轉(zhuǎn)染組中，dsP21-322能夠激活ACHN細胞、5637細胞中p21基因表達；②dsP53-3能夠抑制ACHN細胞、5637細胞中p53基因表達；③在共轉(zhuǎn)染組中ACHN細胞、5637細胞中p53基因下調(diào)，而dsP21-322依然能夠激活p21基因表達。結論外源合成的 saRNA 分子dsP21-322能激活ACHN細胞、5637細胞中p21基因表達，該激活效應不受p53蛋白表達量的影響。

siRNA ； saRNA； RNA干擾； RNA激活

p21基因是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，它負調(diào)節(jié)著細胞周期中由G1期過渡到S期的變化。文獻報道p21基因表達調(diào)控有兩個路徑[1]，即p53依賴途徑和p53非依賴途徑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)針對p21基因啟動子序列設計與其互補配對的小雙鏈RNA(dsRNA)分子dsP21-322能在基因轉(zhuǎn)錄水平激活p21基因表達[2]，但這個基因激活過程是否需要p53蛋白的參與尚不清楚。本文研究分別抑制含有野生型或突變型p53蛋白的細胞株，采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)抑制p53蛋白表達后，對dsP21-322激活p21效應是否產(chǎn)生影響?，F(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、材料與試劑

腎癌ACHN細胞(p53 野生型)、膀胱癌5637細胞(p53 突變型)為本院泌尿外科研究所保種培養(yǎng)；SYBR Premix Ex TapTMⅡ(TaKaRa公司)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、引物合成和Opi-MEM培養(yǎng)液(Invitrogen公司)，DMEM高糖型培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液(GIBICO公司)，RNA提取試劑盒(Axygen公司)，ReverTra Ace-α-TM(TOYOBO公司)，dsRNA合成由廣州銳博生物有限公司提供；p21與p53抗體(CST公司)。

二、dsRNA的合成

人工合成與p21基因啟動子區(qū)-322位點相對應的saRNA片段以及同樣長度的與體內(nèi)已知RNA序列無同源性的陰性對照dsRNA分子dsCon。針對p21基因啟動子區(qū)上游-322bp位點起始的dsRNA分子dsP21-322，其序列為：dsP21-322-S:5′-CCAACUCAUUCUCCAAGUAdTdT；dsP21-322-AS：dTdTGGUUGAGUAAGAGGUUCAU-5′。同樣長度的與體內(nèi)已知RNA序列無同源性的陰性對照dsRNA分子dsCon的序列為：dsControl-S：5′-ACUACUGAGUGACAGUAGAdTdT；dsControl-AS：dTdTUGAUGACUCACUGUCAUCU-5′，cy3標記正義鏈3′端，可熒光顯色。廣州銳博生物有限公司提供3個針對p53基因mRNA用于干擾p53基因的siRNA，分別為dsP53-1、dsP53-2、dsP53-3。

三、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

膀胱癌細胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，腎癌ACHN細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、5%CO2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)、傳代。為提高轉(zhuǎn)染效率，擬轉(zhuǎn)染前兩代用無雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng),用0.25% Trypsin (胰蛋白酶)-0.02% EDTA (依地酸二鈉)消化后吹打成單細胞懸液，以4×105個/孔的密度接種于6孔板中，加入2 ml無雙抗培養(yǎng)液震蕩使細胞分布均勻。6孔板種植細胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細胞匯合度達到50%左右。將稀釋好的dsRNA和 Lipofectamin2000 試劑混合，形成dsRNA/Lipofectamin2000復合物。將dsRNA轉(zhuǎn)染載體加到含有細胞和Opi-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)板的孔中融合，然后放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細胞紅色熒光素的分布以檢測轉(zhuǎn)染效率。

四、dsP53沉默效應的測定及篩選

在dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3中篩選出能夠沉默p53基因并效應最強的一個siRNA序列用于之后共轉(zhuǎn)染的實驗。以膀胱癌5637細胞進行篩選測定，將dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3分別稀釋后與Lipofectamine2000試劑混合，形成siRNA/ Lipofectamine2000復合物，再將轉(zhuǎn)染復合物加入到各個含有膀胱癌5637細胞與Opi-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)板孔中，使siRNA濃度為50 nmol，總體積為2 ml，然后放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細胞紅色熒光素的分布以檢測轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)板板中各孔分成3組：①空白組，只加入Lipofectamine2000試劑； ②陰性對照組，加入dsRNACon 和Lipofectamine2000試劑；③實驗組, 分別加入dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3和Lipofectamine2000試劑形成的siRNA/ Lipofectamine 2000復合物于3個孔中，48 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-time PCR觀察p53沉默效應，從中選出效應最強的一個參與后續(xù)試驗。

五、p53是否參與dsP21-322激活p21基因的測定

將dsP53、dsP21-322、dsCon稀釋后與Lipofectamine2000試劑混合，形成dsRNA/Lipofectamine2000復合物，再將轉(zhuǎn)染復合物加入到各個含有細胞和Opi-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)板孔中，使dsRNA濃度為50 nmol，然后放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液或含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細胞紅色熒光素的分布以檢測轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)板板中各孔分成5組: ①空白組，只加入Lipofectamine2000試劑； ②陰性對照組，加入dsCon 和Lipofectamine2000試劑； ③實驗組1，加入dsP53和Lipofectamine2000試劑； ④實驗組2，加入dsP21-322和Lipofectamine2000試劑；⑤實驗組3，加入dsP53、dsP21-322和Lipofectamine2000試劑。調(diào)整dsRNA終濃度為50 nmol，總體積為2 ml。48 h后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-time PCR觀察p53與p21的轉(zhuǎn)錄水平差異，72 h后提取蛋白行Western-blot觀察兩者翻譯水平差異。

六、總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

運用從Axygen公司購買的RNA提取試劑盒提取總RNA。各樣本取2 ng～2 μg總RNA，按ReverTra Ace-α-TM(TOYOBO公司)說明進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

七、Real-time PCR與Western-blot

應用實時熒光定量PCR檢測，GAPDH基因作為內(nèi)參對照。反應體系為20 μl總體系，反應條件95 ℃ 3 min預變性，循環(huán)內(nèi)95 ℃ 10 s變性，55 ℃退火30 s，PCR反應設置39個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線。所用p53引物為Forward primer：CGTCAGAAGCACCCAGGACT；Reverse primer：CATCCTCCTCCCCACAACAA。p21基因的引物為Forward primer：TCCTCTAGCTGTGGGGGTGA；Reverse primer：GAAGGTCGCTGGACGATTTG。GAPDH基因引物為Forward primer：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；Reverse primer：AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

冷PBS洗滌細胞兩次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收獲蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后, 于100 V泳道進行SDS-PAGE; 電泳結束后,以30 mA ,120 min 將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜; 封閉液(5%BSA/TBST) 封閉60 min, 加入一抗(1∶3 000) 4 ℃過夜, 二抗(1∶6 000) 室溫下雜交120 min, TBST洗膜三次后用ECL試劑盒進行發(fā)光反應, 壓片、顯影、定影, 觀察蛋白印跡, 并進行圖像分析。

八、統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件分析檢驗。計量資料均采用均數(shù)±標準差來描述，兩組間采用t檢驗，多個不同處理組組內(nèi)、組間計量資料的比較應用單因素方差分析。取雙側為檢驗標準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、dsP53 的沉默效應測定

經(jīng)Real-time PCR測定，dsP53-1、dsP53-2、 dsP53-3對p53均有沉默作用，其中dsP53-3的沉默效應最為明顯(圖1)，其序列為：5′-CUACUUCCUGAAAACAACGdTdT-3′，用于本研究的后續(xù)工作。

二、dsP53與dsP21-322共轉(zhuǎn)染對p53和p21基因在轉(zhuǎn)錄水平上的影響

經(jīng)Real-time PCR測定，如圖2所示：①在dsP21-322單轉(zhuǎn)染組中，dsP21-322能夠激活ACHN細胞、5637細胞中p21基因表達；②在dsP53單轉(zhuǎn)染組中，dsP53能夠抑制ACHN細胞、5637細胞中p53基因表達；③在dsP21-322與dsP53共轉(zhuǎn)染組中，ACHN細胞、5637細胞中p53基因下調(diào)，而p21基因的表達仍上調(diào)，提示在p53基因表達受到抑制的情況下，dsP21-322依然能夠激活p21基因。

圖1 不同siRNA分子抑制5637細胞p53基因表達

圖2 抑制p53基因表達對dsP21-322激活效應影響

三、dsP53與dsP21-322共轉(zhuǎn)染對p53和p21基因在翻譯水平上的影響

經(jīng)Western-blot測定，如圖3、4所示：①dsP21-322能夠激活ACHN細胞、5637細胞中p21基因表達，兩個細胞株中的p21蛋白均上調(diào)；②dsP53能夠沉默ACHN細胞、5637細胞中p53蛋白表達；③兩種細胞株中p53蛋白表達下調(diào)不影響dsP21-322分子對p21基因的激活效應。

圖3 抑制p53蛋白表達對5637細胞p21基因激活效應影響

圖4 抑制p53蛋白表達對ACHN細胞p21基因激活效應影響

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與基因的異常表達或失活有關。近年的研究發(fā)現(xiàn)RNA分子能在多個水平參與基因表達的調(diào)控，如RNAi，即將目的基因所對應的dsRNA導入細胞，導致相應的mRNA 降解，從而阻斷特定基因的表達；另有報道dsRNA可使相應基因啟動子區(qū)域DNA的同源序列段CpG島發(fā)生甲基化，并導致相應的基因失去轉(zhuǎn)錄活性，造成特定基因沉默[3-4]。這些技術或方法可以特異性地抑制癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，因而可用于腫瘤治療。

RNA激活(RNA activation, RNAa)是近年來新發(fā)現(xiàn)的由dsRNA直接激活目的基因的一種新的基因表達調(diào)節(jié)機制，這些dsRNA被稱為“小分子激活RNA(saRNA)，它們起到與RNAi相反的作用效果[5-6]。在人體內(nèi)也同樣具有內(nèi)源性的microRNA產(chǎn)生RNAa效應[7]。RNAa的發(fā)現(xiàn)具有重要的理論和實踐意義[8-9]：①豐富了dsRNA參與基因表達調(diào)控理論，是RNAi理論的重要補充；②RNAa可用于多種疾病的治療，特別是腫瘤疾病(如通過特異性激活一系列抑癌基因)、心血管疾病(如激活血管內(nèi)皮細胞生長因子用于冠心病的治療)、代謝及遺傳性疾病，并且在干細胞的定向激活和分化方面，RNAa可以做到RNAi不能完成的工作。

p21基因表達調(diào)控有兩個路徑，即依賴p53途徑和非依賴p53途徑。前者中，p53 通過與p21基因啟動子上游分別位于2 400 bp 和8 000 bp 處的兩個p53 蛋白結合區(qū)的特異性結合而誘導p21基因的表達；后者中，Sp1/Sp3和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在p21基因啟動子區(qū)-119位點附近特異性結合誘導p21基因的表達。然而我們所設計的針對p21基因啟動子-322位點的saRNA(dsP21-322)的核酸序列并不與p53蛋白誘導p21基因表達的結合位點一致。

p53基因分為野生型和突變型兩個亞型，文獻報道只有野生型p53蛋白方能促進p21基因的表達[10]。本實驗選取腎癌ACHN細胞、膀胱癌5637細胞兩個細胞株正是因為腎癌ACHN細胞中p53基因為野生型，而膀胱癌5637細胞中p53基因為突變型。從實驗結果看，外源合成的saRNA 分子dsP21-322均能激活兩者p21基因的表達。無論p53基因是野生型還是突變型，當p53表達受到抑制時，均不影響dsP21-322介導的p21基因激活效應。

目前 RNAa已得到國際上越來越多學者的認可，雖然p53是否直接或間接參與這一激活過程還不得而知，但本研究表明dsP21-322的激活效應不受p53蛋白的影響。dsP21-322激活p21基因的詳細機制并不十分清楚，還需要進行更為廣泛而深入的研究。

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(本文編輯：徐漢玲)

Affect of down-regulation of expression of p53 gene to saRNA activate p21 gene

WUJia,CHENZhong,YANGWei-min,WANGCheng-he,GEQiang-qiang,HUJia.DepartmentofUrology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Correspondingauthor:CHENZhong,E-mail：chenzhongtj@126.com

Objective To investigate the effect of down-regulation of expression of p53 gene on saRNA activate p21 gene. Methods Culturey human kidney cancer cell line ACHN (wild-type p53) and human bladder cancer cell line 5637(mutant p53) in vitro. Synthesized the sequence-specific corresponding saRNA fragments of the promoter of p21 gene, sequence-specific corresponding siRNA fragments of mRNA of p53 gene，and negative control small dsRNA dsCon. Co-transfected into human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 in vitro, respectively with lipofecta-mine reagent, Real-time PCR and Western-blot were performed to examine the difference expression level of p53 and p21 in each group. Results ①p21 gene expression in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 significantly increased. ②p53 gene expression in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637 significantly declined. ③when p53 gene down regulated in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637,p21 gene expression significantly increased. Conclusions Synthetic saRNA dsP21-322 can activate both the p21 gene in human kidney cancer cell line ACHN and human bladder cancer cell line 5637, when the p53 gene is down regulated , regardless of the p53 gene is wild-type or mutant , did not affect the dsP21-322 to activate the p21 gene.

siRNA ； saRNA； RNA interference； RNA activation

430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科

陳忠，E-mail：chenzhongtj@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.009

2015-11-17)