一株家禽羽毛角蛋白降解菌的分離與鑒定

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一株家禽羽毛角蛋白降解菌的分離與鑒定

賈良輝(1977-)，男，浙江義烏人，副教授，博士，主要從事微生物代謝工程和化學(xué)生物學(xué)研究。E-mail：jiaLianghui@nwSuaf.edu.cn

周童娜，楊文翰，趙江婷，趙婷婷，安曉英，顏華*，賈良輝*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]為了探尋降解家禽羽毛角蛋白的微生物資源，利用富集及馴化培養(yǎng)的方法，從家禽養(yǎng)殖場長期堆積廢棄羽毛的土壤中，分離能夠有效降解羽毛角蛋白的細(xì)菌，并對其降解效果進(jìn)行初步研究，結(jié)果分離篩選出1株能以羽毛角蛋白為唯一碳氮源的菌株N01。經(jīng)形態(tài)特征觀察，生理生化特征鑒定和16S rDNA序列分析，初步鑒定其屬于節(jié)桿菌屬。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌株與金黃色節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)的相似性最高，達(dá)99%，因而確定其為金黃色節(jié)桿菌。該菌株經(jīng)過72 h發(fā)酵，對羽毛角蛋白的降解率達(dá)75%，表明該菌株對羽毛角蛋白有明顯的降解作用。該菌株的分離鑒定為微生物降解利用家禽羽毛角蛋白提供了新的種質(zhì)資源。

[關(guān)鍵詞]羽毛角蛋白；角蛋白降解菌；分離；鑒定

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展推進(jìn)了家禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；a(chǎn)，但隨之而來的家禽羽毛廢棄物堆積問題日益突出，這不僅給周圍生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重的壓力，而且造成了家禽羽毛蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。家禽羽毛由近90%的角蛋白組成，富含動物所需的多種必需氨基酸，但家禽羽毛角蛋白的性質(zhì)極其穩(wěn)定，很難被一般的蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)分解，因此家禽對其消化率較低[1-2]。但是，家禽羽毛角蛋白經(jīng)過有效降解后可以加工成動物飼料[3]。傳統(tǒng)的高溫高壓降解和酸堿水解工藝可在一定程度上提高羽毛蛋白消化率，但這些方法往往會破壞一些氨基酸，同時存在能耗大、三廢不易處理等問題，極易造成環(huán)境污染，而且飼料消化和利用率不高[4-5]。近年來，微生物降解法作為一種既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的舉措引起了人們廣泛關(guān)注。該方法在不破壞氨基酸的基礎(chǔ)上能夠改變角蛋白結(jié)構(gòu)，同時具備消耗少、污染小的特點，在最大程度上提高家禽羽毛的營養(yǎng)價值和利用率[4]，促進(jìn)了家禽羽毛在飼料業(yè)的發(fā)展。

土壤中降解角蛋白的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌等，目前分離得到的細(xì)菌大多屬于芽孢桿菌屬，包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[6-10]等，菌種資源單一限制了降解角蛋白微生物資源的開發(fā)與利用。本研究從長期堆積廢棄羽毛的土壤中，分離到一株能高效降解羽毛角蛋白的細(xì)菌，并對其進(jìn)行了分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及降解特性的研究，豐富了角蛋白降解菌的微生物資源。

1材料與方法

1.1　材　料

1.1.1土樣供試土壤采自陜西省楊凌區(qū)崔西溝某養(yǎng)雞場長期堆積廢棄羽毛處。

1.1.2羽毛粉將雞羽毛用洗滌劑揉搓洗凈，并用自來水徹底沖洗，剪去羽毛梗頭部，121 ℃高壓滅菌1 h，然后90 ℃烘24 h后粉碎，過100目篩。

1.1.3培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：羽毛粉10.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.4 g，瓊脂粉 20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：羽毛粉10.0 g/羽毛10根，NaCl 0.5 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.35 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉 20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

1.2　方　法

1.2.1微生物的分離篩選稱取1 g土樣加10 mL無菌生理鹽水充分混勻，將其梯度稀釋后涂布在含有1%的羽毛粉作為唯一碳氮源的選擇培養(yǎng)基上，篩選出產(chǎn)水解圈的菌落。將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，觀察羽毛降解情況，選取羽毛降解最徹底的菌株劃線分離純化，從而在土壤中分離得到一株能夠降解羽毛角蛋白的菌株，暫定名為N01。

1.2.2菌落形態(tài)觀察將菌株N01接種在LB培養(yǎng)基平板上，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24~96 h。肉眼觀察菌落的形狀、顏色、表面質(zhì)地、透明度和菌落邊緣。

1.2.3菌體形態(tài)觀察將菌株N01制片進(jìn)行革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)。

1.2.4生理生化特征測定參照《微生物分類學(xué)》[11]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[12]進(jìn)行菌株N01生理生化特性的測定。

1.2.516S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析用菌株N01的基因組DNA作模板,以16S rDNA通用引物進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。上游引物：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，下游引物：1522R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(with MgCl2) 5.0 μL，dNTPs(25 mM) 4.0 μL，引物(10 μM)各1.0 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，模板 1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；50 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸2 min，33個循環(huán)；72 ℃長延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，陽性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將菌株N01的16S rDNA序列，在GenBank網(wǎng)站中進(jìn)行 BLAST分析，通過Mega 5.0以Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap(重復(fù)數(shù)為1 000)進(jìn)行檢驗。

1.2.6角蛋白降解效果觀察以接種環(huán)挑取一環(huán)菌物接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。種子液以4%接種量接種到含一根完整羽毛的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，以不接種的培養(yǎng)基作對照。37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)數(shù)天，觀察培養(yǎng)液中羽毛的降解情況。

1.2.7角蛋白降解率測定采用失重法測定[13]。以接種環(huán)挑取一環(huán)菌物接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。種子液以4%接種量分別接種于裝有50 mL羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，3 000 r/min 離心10 min，取殘渣至干燥箱內(nèi)干燥至恒重，計算降解率。角蛋白降解率(%)=(羽毛粉干重-殘渣干重) / 羽毛粉干重×100。

1.2.8菌株發(fā)酵實驗將菌株N01接種于羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于不同溫度條件下：24 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃ 和37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測定菌株N01發(fā)酵的最適溫度。

1.2.9角蛋白酶活力的測定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行菌株N01角蛋白酶活力的測定。

2結(jié)果與分析

2.1　菌株篩選鑒定

2.1.1菌落形態(tài)特征菌株N01分離自以羽毛角蛋白作為唯一碳氮源的選擇培養(yǎng)基(見圖1)，將其接種在LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24~96 h后觀察菌落形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)菌落呈圓形，凸起，表面光滑、濕潤，邊緣整齊，不透明。幼齡菌落呈乳白色，隨著菌齡的增長菌落逐漸呈金黃色，見圖2。

2.1.2菌體形態(tài)特征菌株N01在LB培養(yǎng)基平板上37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，6 h培養(yǎng)物鏡檢后，發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞呈球狀，僅個別細(xì)胞為短桿狀；24 h培養(yǎng)物鏡檢后，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞呈不規(guī)則桿狀，呈V字排列。

2.1.3菌株生理生化特征菌株N01革蘭氏呈陽性，能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇，不能利用乳糖，對木糖和鼠李糖利用情況不明。菌株N01在不含NaCl的培養(yǎng)基中生長良好，隨著鹽濃度的增大，菌株生長明顯受到抑制。菌株N01在pH 5.0~8.0范圍內(nèi)生長良好，說明菌株N01的適應(yīng)范圍較廣。菌株N01的生理生化特征見表1。

2.1.416S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析N01 16S rRNA基因擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖3所示。測序結(jié)果顯示，菌株N01 16S rDNA序列全長為1 475 bp(Gene Bank登錄號為NR 074272.1)，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，根據(jù)同源性比對結(jié)果，通過Mega 5.0軟件采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。菌株N01與Arthrobacteraurescens(金黃色節(jié)桿菌)的進(jìn)化距離最近，結(jié)合形態(tài)觀察與生理生化特征，初步鑒定N01為金黃色節(jié)桿菌，命名為ArthrobacteraurescensN01。

圖1　菌株N01在選擇培養(yǎng)基上的生長情況

圖2　菌株N01在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

Fig.2 Colony morphology of the strain N01 on LB medium

表1　菌株N01的生理生化特征

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)；“+-”表示結(jié)果不確定。

Note:“﹢” denotes positive;“﹣” denotes negative;“﹢﹣” denotes the variable result.

圖3　菌株N01 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2　角蛋白降解

2.2.1角蛋白降解效果觀察隨時間的增加，發(fā)酵培養(yǎng)基由清亮逐漸變得渾濁。培養(yǎng)基中的完整羽毛，先是羽毛小枝逐漸脫落，小枝羽毛完全脫落后只剩羽毛梗，隨后羽毛梗逐漸斷裂，培養(yǎng)9 d后羽毛梗完全降解，培養(yǎng)基成為均一的混懸液(如圖5所示)。對照組的羽毛基本沒有變化。

2.2.2角蛋白降解率100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測得角蛋白降解率為75%。

圖4　鄰接法構(gòu)建的菌株N01 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹.系統(tǒng)發(fā)育樹分支上的數(shù)值表示可信度，標(biāo)尺表示分支距離

圖5　Arthrobacter aurescens N01發(fā)酵9天降解羽毛效果

2.3　菌株N01降解角蛋白最適溫度

溫度對菌株角蛋白降解率的影響見圖6。從圖中可知，菌株降解角蛋白的最適溫度是30 ℃，低于或高于30 ℃角蛋白降解率都迅速下降，這是由于溫度過低不利于菌體的生長，延緩了角蛋白酶的產(chǎn)生，從而抑制了角蛋白的降解；溫度高于30 ℃雖對菌體生長影響不大，卻抑制了角蛋白酶的活性，從而導(dǎo)致角蛋白降解率的下降。

2.4　角蛋白酶活力

菌株ArthrobacteraurescensN01接種于100 mL羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，20 h就可以檢測到明顯的角蛋白酶活性，72 h角蛋白酶活性達(dá)到最高，為14 U/mL。在30 ℃，180 r/min培養(yǎng)96 h的條件下，菌株的角蛋白酶酶活變化見圖7。

圖6　溫度對Arthrobacter aurescens N01角蛋白降解率的影響

圖7　菌株Arthrobacter aurescens N01角蛋白酶酶活的測定

3討論

家禽羽毛角蛋白中，蘇氨酸、賴氨酸等氨基酸的含量高于豆粕，有效降解的羽毛粉可以代替5%~10%的豆粕作為蛋白質(zhì)飼料[15]。微生物降解法不僅能有效降解家禽羽毛角蛋白，而且可以改善蛋白的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)動物生長，從而代替部分豆粕。該方案在緩解蛋白質(zhì)飼料緊缺問題的同時，既節(jié)省了蛋白質(zhì)資源，又降低了生產(chǎn)成本[16-17]。

目前已發(fā)現(xiàn)30余種能降解角蛋白的微生物，分別屬于真菌、放線菌和細(xì)菌[18]。真菌中的皮膚癬菌和白假絲酵母(Candidaalbicans)，放線菌中的鏈霉菌(Streptomyces)和高溫單胞菌屬(Thermonspora)及細(xì)菌中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)都是降解角蛋白的主要類群[19-21]。降解角蛋白的真菌最早被研究，不過這些真菌往往具有致病性，所以具備商業(yè)開發(fā)價值的菌株為數(shù)不多。然而，研究發(fā)現(xiàn)金黃色節(jié)桿菌(Arthrobacteraurescens)不僅對Zn2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+和Co2+等重金屬具備較高的抗性水平[22]，而且能分泌產(chǎn)生高效、安全的新型溶栓酶，用于治療心腦血管疾病[23]，可見該菌株的篩選不僅豐富了降解羽毛微生物的種類，而且在飼料業(yè)具備較好的應(yīng)用前景，為家禽羽毛廢棄物在蛋白飼料和醫(yī)藥衛(wèi)生[24]方面的應(yīng)用提供了優(yōu)良菌株。在發(fā)酵實驗中，該菌在溫度30 ℃，pH 6.0的條件下表現(xiàn)出較高的羽毛降解能力和酶活性，對于其最佳發(fā)酵條件、酶學(xué)性質(zhì)及降解羽毛的機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

本研究從家禽養(yǎng)殖場長期堆積廢棄羽毛的土壤中，分離到一株新的能有效降解羽毛角蛋白的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征研究和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定為金黃色節(jié)桿菌ArthrobacteraurescensN01。迄今為止，國內(nèi)外還未見該菌用于降解羽毛角蛋白的相關(guān)報道,這說明菌株N01是目前研究降解羽毛微生物的一個新成員。

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Isolation, Identification and Characterization of One Strain of New Feather-Degrading Bacteria

ZHOU Tong-na, YANG Wen-han, ZHAO Jiang-ting, ZHAO Ting-ting,

AN Xiao-ying, YAN Hua, JIA Liang-hui

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi712100,China)

Abstract:The aim of this study was to obtain feather-degrading bacteria, investigate its degradation effect, and develop the exploitation and utilization of feather-keratin resources, especially new process of feather-biodegradation by microorganisms. A strain was isolated from environment soil collected from the chicken feather waste site of a local poultry farm by the method of enrichment and domestication. It can grow by using feather as the sole source of carbon and nitrogen. The strain was preliminarily identified by morphology observation, physiological and chemical characteristics and phylogenetic analysis as the Arthrobacter. Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of the strain had the highest sequence identity with Arthrobacter aurescens (99%). Based on 16S rDNA sequence analysis as well as physiological and biochemical property, the strain was identified as Arthrobacter aurescens N01. The degradation rate of feather was up to 75% after 72 h fermentation. It can be seen this bacterium has a strong effect on degradation of feather. Up to date, feather degradation by Arthrobacter has not been reported by far, thus, we provid a new efficient keratin-degraded bacterium to utilize feather.

Key words:feather keratin; feather-degrading bacteria; isolation; identification

[中圖分類號]S811.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1005-5228(2015)11-0037-05

*[通訊作者]顏華(1976-)，女，山東寧陽人，副教授，博士，主要從事微生物分子遺傳與分子代謝工程研究。E-mail：yanh99@gmaiL.com

[作者簡介]周童娜(1989-)，女，榆林米脂人，在讀碩士，主要從事微生物分離及萜類生物合成途徑中相關(guān)酶研究。E-mail：zhoutongna@163.com

[基金項目]引進(jìn)人才專項(Z111021104)；引進(jìn)人才專項(Z111021105)和2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201410712074)

*[收稿日期]2016-06-16修回日期：2015-07-12