4種酶質(zhì)量濃度對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離效果的比較

黃 瑞， 朱偉杰

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化中心，廣東湛江524001；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，發(fā)育與再生生物學(xué)系，廣東廣州510632）

4種酶質(zhì)量濃度對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離效果的比較

黃 瑞1，2， 朱偉杰2

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化中心，廣東湛江524001；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，發(fā)育與再生生物學(xué)系，廣東廣州510632）

目的：比較4種酶質(zhì)量濃度對(duì)原代小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離效果.方法：將20只成年雄性昆明小鼠睪丸平均分成A、B、C、D 4組，分別用0.05%、0.125%、0.25%胰酶和0.02%膠原酶Ⅱ消化分離睪丸間質(zhì)細(xì)胞，比較4種酶質(zhì)量濃度分離的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和存活率；分別用蘇木素-伊紅染色、蘇丹Ⅲ染色觀察間質(zhì)細(xì)胞及其脂滴形態(tài).結(jié)果：A組和B組分離的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)多于C組和D組（P＜0.05）.4種酶質(zhì)量濃度所分離的間質(zhì)細(xì)胞存活率均在90%以上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.低濃度胰酶（0.05%和0.125%）所分離的間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞內(nèi)脂滴小而豐富，長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)后胞質(zhì)空泡化，脂滴發(fā)生融合.結(jié)論：低質(zhì)量濃度胰酶對(duì)原代間質(zhì)細(xì)胞分離效果好.

間質(zhì)細(xì)胞； 胰酶； 膠原酶Ⅱ； 脂滴； 小鼠

［Key words］leydig cells； trypsin； collagenase II； lipid droplet； mouse

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell，LC）分布于曲細(xì)精管之間的疏松結(jié)締組織中，其功能是合成和分泌雄激素［1-2］.LC的功能狀態(tài)與維持雄性睪酮水平和生殖健康有密切聯(lián)系.體內(nèi)LC睪酮合成和分泌功能受多種內(nèi)分泌和旁分泌共同調(diào)節(jié)，對(duì)體內(nèi)LC功能的研究有難度.體外分離培養(yǎng)的LC在形態(tài)結(jié)構(gòu)上維持了其原有特征并具有睪酮分泌能力，因此，離體LC已廣泛應(yīng)用于生殖生理、病理、藥理、毒理及能量代謝等研究領(lǐng)域［3-6］.

原代LC分離培養(yǎng)是LC體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ).原代LC分離的方法主要是利用膠原酶Ⅱ消化或膠原酶Ⅱ結(jié)合0.25%胰酶消化，Percoll密度梯度離心分離［7-9］.但此類方法不僅操作步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，而且細(xì)胞損耗量大.由于LC對(duì)機(jī)械操作比較敏感，長(zhǎng)時(shí)間和反復(fù)處理會(huì)對(duì)LC產(chǎn)生不利影響，離體時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞不利影響越大.本實(shí)驗(yàn)采用4種酶質(zhì)量濃度對(duì)LC進(jìn)行短時(shí)間消化，利用LC比其他類型生精細(xì)胞貼壁快的特點(diǎn)進(jìn)行差速貼壁分離，比較4種酶質(zhì)量濃度對(duì)LC的分離效果及貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和脂滴形態(tài)，以期建立簡(jiǎn)單高效的LC體外分離培養(yǎng)體系，增進(jìn)對(duì)原代LC體外生長(zhǎng)規(guī)律及其功能狀態(tài)的了解，豐富LC體外培養(yǎng)資料.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4月齡成年雄性昆明小鼠20只，SPF級(jí)，體質(zhì)量40～50g，由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

1.2 主要試劑和儀器

DMEM／F12培養(yǎng)液（美國HyClone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；膠原酶Ⅱ（美國Sigma公司）；臺(tái)盼藍(lán)（美國Sigma公司）；蘇丹Ⅲ染料（上海試劑三廠）；35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Becton Dickinson公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）.

1.3 方法

（1）小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將20只小鼠隨機(jī)平均分為A、B、C、D 4組，每組5只（n＝5），分別標(biāo)記為0.05%胰酶組、0.125%胰酶組、0.25%胰酶組和0.02%膠原酶Ⅱ組.從A、B、C、D 4組中各取1只小鼠，頸椎脫臼法將小鼠處死，用0.1%新潔爾滅浸泡消毒5 min后，放入提前高壓滅菌的玻璃培養(yǎng)皿，用無菌手術(shù)剪剪開小鼠腹部皮膚，眼科剪和鑷子小心將小鼠睪丸取出（保持白膜完整性），立即將睪丸標(biāo)本依次放入3～5個(gè)盛有預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的培養(yǎng)皿中洗滌，以徹底清洗可能黏在睪丸上的毛發(fā)或其他雜質(zhì)，體視鏡下小心地去除白膜.將各組小鼠的雙側(cè)睪丸實(shí)質(zhì)分別放入對(duì)應(yīng)的酶消化液中，37℃震蕩消化20 min.消化完成后，用200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，300 g離心10 min，棄去上清液，用PBS洗滌重懸細(xì)胞，250 g離心5 min，重復(fù)3次.充分洗滌后用1 mL含10%胎牛血清的DMEM／F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率并計(jì)數(shù)細(xì)胞.調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL并接種到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).采用差速貼壁分離的方法，在接種24 h后及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液［10］.LC培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度并將細(xì)胞接種到新培養(yǎng)皿培養(yǎng).

（2）小鼠睪丸LC蘇木素-伊紅染色（HE染色）調(diào)整LC密度為1×105／mL并接種到事先放入無菌蓋玻片的培養(yǎng)皿.待細(xì)胞充分貼壁伸展時(shí)，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，立即用中性甲醛固定15～20 min.細(xì)胞固定后進(jìn)行細(xì)胞HE染色程序.

（3）小鼠睪丸LC脂滴染色 飽和蘇丹Ⅲ染液的配制：將0.2 g蘇丹Ⅲ粉末溶解于50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，過濾去除未溶解的顆粒.

LC脂滴染色：LC細(xì)胞固定20～30 min后，棄去固定液，用PBS洗滌3次，每次3min，蘇木素染色2 min后蒸餾水洗30 s，酸性乙醇分化2 s，用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%乙醇各30 s，蘇丹Ⅲ染液染色30 min，體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇分化5～10 s，體積分?jǐn)?shù)為50%緩沖甘油封片.染色過程中，將液體沿培養(yǎng)皿壁輕輕加入，避免液體直接沖擊細(xì)胞而使細(xì)胞脫落.

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示.組間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 4種酶質(zhì)量濃度對(duì)間質(zhì)細(xì)胞消化后曲細(xì)精管的狀態(tài)

酶對(duì)LC的消化效果以曲細(xì)精管完整、管壁外附著間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)少為好.在相同條件下，C組和D組LC消化效果較差，消化后曲細(xì)精管周圍仍附著有較多未被消化的細(xì)胞團(tuán)，且曲細(xì)精管大部分扭成團(tuán)狀，D組曲細(xì)精管片段較多（圖1A）；A和B組消化后只有少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)仍附著在曲細(xì)精管周圍，消化后曲細(xì)精管呈松散的絮狀，完整性好（圖1A，B），消化效果優(yōu)于C組和D組.

圖1 酶消化后的曲細(xì)精管（×40）Fig.1 The seminiferous tubules after digestion（×40）

2.2 4種酶質(zhì)量濃度所分離的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和存活率檢測(cè)

A、B、C、D 4組酶質(zhì)量濃度消化分離的LC數(shù)分別為（7.7±3.1）×106／mL、（6.6±3.0）×106／mL、（3.1±0.5）×106／mL和（1.0±0.1）×106／mL，其中，C組和D組分離的LC數(shù)分別顯著低于A組和B組（P＜0.05）.臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，4種酶質(zhì)量濃度分離的LC存活率均在90%以上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

2.3 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和觀察

（1）小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng) 體外分離培養(yǎng)24 h后，LC大部分貼壁并開始極化，少部分細(xì)胞尚未完全貼壁.傳代后48 h的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞質(zhì)豐滿，細(xì)胞分裂速度快，接種后培養(yǎng)3 d即可長(zhǎng)滿1個(gè)6孔板（圖2）.連續(xù)傳代培養(yǎng)2周后，細(xì)胞活性開始減退，出現(xiàn)貼壁細(xì)胞不飽滿、細(xì)胞突起逐漸收縮以及胞質(zhì)空泡化等老化現(xiàn)象，繼續(xù)消化傳代后未貼壁的細(xì)胞數(shù)增多.

圖2 貼壁后的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Fig.2 Adherentmouse Leydig cells

（2）小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞爬片HE、脂滴染色觀察

細(xì)胞爬片HE染色結(jié)果顯示（圖3），體外培養(yǎng)的LC細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，位于細(xì)胞胞質(zhì)中央或一側(cè)，核內(nèi)有1～2清晰可見的個(gè)核仁，核仁多位于細(xì)胞核邊緣；胞質(zhì)輪廓多為梭形或不規(guī)則多角形，有3～5個(gè)細(xì)胞突起；培養(yǎng)一段時(shí)間后偶見細(xì)胞融合，形成多核LC.LC脂滴經(jīng)蘇丹Ⅲ染色后呈橘紅色，圓球形懸浮狀存在于細(xì)胞胞質(zhì)兩極或細(xì)胞核周圍（圖4A）.體外培養(yǎng)老化后的LC胞質(zhì)內(nèi)有許多空泡，存在脂滴融合甚至從胞質(zhì)溢出的現(xiàn)象（圖4B）.

圖3 間質(zhì)細(xì)胞爬片H＆E染色Fig.3 Leydig cell H＆E staining

圖4 間質(zhì)細(xì)胞脂滴形態(tài)（蘇丹Ⅲ染色；×1 000）Fig.4 The lipid droplets inmouse Leydig cells（SudanⅢstaining；×1 000）

3 討論

睪丸LC分離培養(yǎng)是LC體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，酶消化法則常用于原代細(xì)胞的消化分離［11-12］.膠原酶的作用是水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，胰酶可水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)從而使細(xì)胞分散，兩種酶在37℃條件下均有良好的消化活性［13］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B兩組（0.05%、0.125%胰酶）消化后的曲細(xì)精管完整性好，大部分LC被消化下來；而C、D兩組（0.25%胰酶、0.02%膠原酶Ⅱ）消化后曲細(xì)精管管壁外仍附著較多間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)，消化效果不理想.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，A、B兩組分離的LC數(shù)目顯著多于C、D兩組.低質(zhì)量濃度膠原酶Ⅱ（0.02%）的消化作用較緩和，對(duì)細(xì)胞損傷小，常用于原代細(xì)胞分離，但所需消化時(shí)間長(zhǎng).在最適溫度條件下，膠原酶Ⅱ需要作用更長(zhǎng)的時(shí)間才能將LC充分消化.高質(zhì)量濃度（0.25%）胰酶的消化作用較強(qiáng)烈，在振蕩消化過程中容易使睪丸實(shí)質(zhì)收縮而造成消化效果不均，因而影響間質(zhì)細(xì)胞的消化效果.采用膠原酶結(jié)合0.25%胰酶進(jìn)行反復(fù)消化，不僅操作步驟多，而且耗時(shí)長(zhǎng)［9］.反復(fù)消化以及離體后長(zhǎng)時(shí)間未用完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，會(huì)直接對(duì)LC活性造成影響.而本實(shí)驗(yàn)采用較低質(zhì)量濃度胰酶進(jìn)行消化、過濾并經(jīng)3～5次洗滌后直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，從LC消化、充分洗滌到細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間不超過1小時(shí)，LC在體外處理時(shí)間短，而且操作步驟簡(jiǎn)便，避免了因反復(fù)操作而引起LC活率降低.此外，用低質(zhì)量濃度胰酶對(duì)LC進(jìn)行消化，可以降低胰酶對(duì)細(xì)胞膜的損傷.

Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒混懸液，對(duì)細(xì)胞無毒性和刺激性，用Percoll液進(jìn)行連續(xù)或非連續(xù)密度梯度離心分離LC，可得到高純度的LC［14-16］.但經(jīng)過Percoll密度梯度離心分離后，細(xì)胞損耗多，需要更多睪丸組織才能得到足夠量的間質(zhì)細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［17］.差速貼壁分離法則是利用間質(zhì)細(xì)胞比支持細(xì)胞、生精細(xì)胞貼壁性好的特點(diǎn)，在其他類型細(xì)胞貼壁之前及時(shí)換液，從而達(dá)到進(jìn)一步分離純化LC的目的［10］.在LC培養(yǎng)24 h后及時(shí)更換培養(yǎng)液，未貼壁的支持細(xì)胞、生精細(xì)胞以及少量活性差的LC可被PBS緩沖液洗去，添加新完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的LC生長(zhǎng)狀態(tài)良好.

貼壁生長(zhǎng)良好的LC呈梭形或多角形伸展，圓形或卵圓形細(xì)胞核有1～2個(gè)明顯可見的核仁.細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多圓形脂滴存在，經(jīng)蘇丹Ⅲ染色后顯示其多分布于細(xì)胞核周圍或細(xì)胞兩極.LC脂滴結(jié)構(gòu)與類固醇合成有密切聯(lián)系，脂滴內(nèi)含大量類固醇合成前體物質(zhì)，為L(zhǎng)C類固醇合成提供原始材料［18］.脂滴外圍包裹著豐富的圍脂滴蛋白，能夠動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)脂滴運(yùn)動(dòng)，保障LC類固醇合成順利進(jìn)行［18-20］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LC胞質(zhì)豐滿，脂滴小，數(shù)量多，而體外連續(xù)傳代培養(yǎng)2周后，部分細(xì)胞開始老化，胞質(zhì)空泡化，脂滴變大甚至有脂滴從胞漿溢出的現(xiàn)象.體外分離培養(yǎng)的原代LC在短期內(nèi)能維持良好活性狀態(tài)，其功能狀態(tài)可能與脂滴形態(tài)和分布存在一定的聯(lián)系，睪丸LC脂滴形態(tài)是否隨體外培養(yǎng)時(shí)間的不同而發(fā)生改變，以及脂滴形態(tài)改變與LC類固醇合成能力之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，低質(zhì)量濃度胰酶對(duì)原代間質(zhì)細(xì)胞分離效果好，所分離的原代LC有高存活率，體外生長(zhǎng)良好，胞質(zhì)豐滿，脂滴小而多.本實(shí)驗(yàn)方案分離培養(yǎng)原代LC簡(jiǎn)單高效，能為后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)研究奠定良好基礎(chǔ).

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［責(zé)任編輯：劉蔚綏］

Com parison of the digestion efficacy ofmouse Leydig cells by using four kinds of enzyme concentrations

HUANG Rui1，2， ZHUWeijie2
（1.Stem Cell Research and Cellular Therapy Center，The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China；2.Department of Developmental and Regenerative Biology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To compare the digestion efficacy ofmouse Leydig cells by using four kinds of enzyme concentrations.M ethods：Testeswere obtained from 20 adult Kunmingmalemice，equally divided into 4 groups（groups A，B，C and D），and were digested by 0.05%，0.125%，0.25%trypsin，and 0.02%collagenaseⅡ，respectively.These four groupswere validated for yield and viability.Hematoxylin-eosin and SudanⅢstaining were used to observe the Leydig cellmorphology and lipid droplets，respectively.Results：The viability of Leydig cellswere similar among 4 groups（P＞0.05）.The yields of Leydig cells in groups A and B were higher than that in groups C and D（P＜0.05）.The healthy growth Leydig cells digested by low concentration trypsin（0.05%and 0.125%）were full of small lipid droplets，while the Leydig cells after long-term in vitro culture displayed vacuolation accompanied by lipid droplet fusion phenomenon.Conclusion：Low concentration of trypsin had better efficacy for Leydig cell isolation.

R332

A

1000-9965（2015）05-0397-05

10.11778／j.jdxb.2015.05.007

2015-07-09

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020213007）

黃 瑞（1986-），女，研究方向：受精機(jī)理與生殖工程，干細(xì)胞研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化，E-mail：gdhyhr＠126.com

朱偉杰，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：受精機(jī)理與生殖工程，生殖免疫，Tel：＋86-20-85225718；E-mail：tzhuwj＠jnu.edu.cn