銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對缺糖缺氧損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用

劉　秋，許治良，周　軍，李　娜，畢宇安，王振中，蕭　偉(中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港　222001)

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銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對缺糖缺氧損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用

劉秋，許治良，周軍，李娜，畢宇安，王振中，蕭偉
(中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001)

中國圖書分類號: R282.71; R284.1; R285.5; R329. 25; R845. 220. 1

摘要:目的探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(YXETNZ)對缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法SHSY5Y細(xì)胞OGD損傷4 h后，與藥物一起復(fù)氧1 h，然后測定細(xì)胞存活率(CCK-8法)、caspase-3/7酶活力、細(xì)胞質(zhì)中核小體含量;蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞中p-Akt、p-PKA、p-Bad蛋白量的變化。結(jié)果OGD明顯提高SH-SY5Y細(xì)胞caspase-3/7酶活力和細(xì)胞質(zhì)中核小體含量，明顯降低細(xì)胞的存活率。YXETNZ能明顯提高OGD損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，抑制caspase-3/7酶活性，減少細(xì)胞核核小體的釋放量，上調(diào)p-Akt、p-PKA和p-Bad激酶蛋白量，提高Akt和PKA活性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)論YXETNZ對OGD損傷的SHSY5Y細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/Bad/caspase-3/7、cAMP/PKA/Bad/caspase-3/7細(xì)胞通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞:銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液;缺糖缺氧損傷;細(xì)胞凋亡; PKA; Akt;Bad

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.021.html

蕭偉(1959－)，男，博士，高級工程師，研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)，通訊作者，Tel: 0518-81152333，E-mail: kanionlunwen@163.com

缺血性腦卒中是常見多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，治療的選擇性小，致死、致殘率高，可由多種原因誘發(fā)。目前已有研究表明，在缺血性腦卒中急性期，細(xì)胞生物能量代謝障礙引起的細(xì)胞去極化、興奮性神經(jīng)毒性和氧化應(yīng)激損傷為主要損害，亞急性期的損害主要是炎癥反應(yīng)，因此造成的神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡是產(chǎn)生各種臨床癥狀與體征的根源，死亡的神經(jīng)元已無法修復(fù)，拯救腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡是治療腦卒中的關(guān)鍵因素［1］。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(YXETNZ)是含銀杏內(nèi)酯B(GB，60%)、銀杏內(nèi)酯A(GA，35%)、銀杏內(nèi)酯K(GK，2%)、銀杏內(nèi)酯C(GC，2%)(Fig 1)的5類新藥，用于腦卒中的治療。研究表明銀杏二萜內(nèi)酯各單體除作為是血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的拮抗劑治療腦卒中外［2］，GA和GB可通過抑制線粒體凋亡途徑來保護(hù)永久性腦缺血大鼠神經(jīng)元［3］，GA和GB還可通過抑制NF-κB活性，降低腦缺血小鼠神經(jīng)元的炎癥和凋亡反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4－5］，GK通過拮抗急性缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元的氧化應(yīng)激保護(hù)神經(jīng)元［6］。本研究采用SH-SY5Y細(xì)胞OGD模型模擬腦缺血性損傷，檢測YXETNZ對體外腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡作用及相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)一步闡明了YXETNZ保護(hù)腦缺血損傷神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制。

Fig 1　Chemical structural formula of ginkgolides

1　材料與方法

1.1材料與儀器SH-SY5Y購自中科院上海細(xì)胞庫; RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;青鏈霉素混合液購自Biotopped公司;胰蛋白酶購自美國Amresco公司; CCK-8試劑盒購自上海貝博公司; caspase-Glo3/7試劑盒購自美國Promega公司; Cell death detection ELISA購自瑞士Roche公司; p-Akt(Ser473)antibody、Akt(pan)antibody、p-PKA(Thr197)antibody、PKA C-alpha antibody、p-Bad(Ser112)antibody、p-Bad(Ser136)antibody、Bad antibody、actin antibody、HRP標(biāo)記二抗購自美國CST公司; CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;缺氧小室購自加拿大Stemcell公司;微孔板檢測系統(tǒng)Flex Station 3購自美國MD公司; ChemiDoc XRS系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(YXETNZ)為江蘇康緣藥業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為130901;金納多注射液(JND)產(chǎn)品批號為H6138。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)，OGD模型和給藥SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)中，置于37℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。將SH-SYSY細(xì)胞接種至細(xì)胞板中培養(yǎng)24 h，以無糖平衡鹽溶液完全置換RPMI 1640培養(yǎng)基置于缺氧小室中，將小室用95% N2和5% CO2混合氣，以20 L·min－1的氣流速度充氣20 min以排出空氣，密封小室，將小室和對照組細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞在缺氧小室中培養(yǎng)一定的時間后，取出細(xì)胞板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，和YXETNZ、JND藥物一起復(fù)氧一定時間。然后進(jìn)行細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和相關(guān)激酶活性的測定。

1.2.2細(xì)胞存活率的測定將SH-SY5Y細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至96孔板中，OGD 4 h后加入終濃度為0. 39、0. 78、1. 56、3. 12、6. 25、12. 50、25. 00、50. 00 mg·L－1的YXETNZ和JND，一起復(fù)氧1 h后，采用CCK-8試劑盒，按說明書每孔加入底物10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，于450 nm處測定各組吸光度值OD450 nm，計算藥物的保護(hù)率(Effection)/% =(藥物組細(xì)胞存活率－模型組細(xì)胞存活率)/模型組細(xì)胞存活率×100%。應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件計算藥物的EC50值，同時確定藥物最佳給藥劑量。

1.2.3 caspase-3/7活性的測定將SH-SY5Y細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至96孔底部不透明白板中，OGD 4 h后分別加入終濃度為25 mg·L－1的藥物，一起復(fù)氧培養(yǎng)1 h，應(yīng)用caspase-Glo3/7試劑盒，參考說明書每孔加入100 μL的酶作用底物，室溫孵育30 min后，用微孔板檢測系統(tǒng)Flex Station 3讀取各組luminescence值。

1.2.4細(xì)胞質(zhì)中核小體含量的測定將SH-SY5Y細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至96孔板中，OGD 4 h后分別加入終濃度為25 mg·L－1的藥物，一起復(fù)氧培養(yǎng)1 h，應(yīng)用Cell death detection ELISA試劑盒，參考說明書，測定細(xì)胞胞質(zhì)中核小體的含量。將各組細(xì)胞室溫裂解30 min后，200×g離心10 min，取上清，與生物素標(biāo)記的抗組蛋白抗體和HRP標(biāo)記的抗DNA抗體混合后加入到包被有鏈霉親和素的酶標(biāo)板中，室溫震蕩孵育2 h，洗滌酶標(biāo)板，加入顯色底物后用微孔板檢測系統(tǒng)測定405 nm處各孔的吸光度，計算各組細(xì)胞胞質(zhì)中核小體的含量，濃縮因子(Enrichment factor)=(OD405 nm藥物組－OD405 nm空白組)/(OD405 nm對照組－OD405 nm空白組)。

1.2.5 Western blot檢測蛋白質(zhì)水平將SH-SY5Y細(xì)胞以每孔1×106的密度接種于6孔板中，收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測定樣品蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，封閉，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗人的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000)溶液室溫孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應(yīng)用ChemiDoc XRS系統(tǒng)拍照，采用Gel-Pro analyzer 4圖像分析軟件進(jìn)行顯影條帶灰度值分析。1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，One-way ANOVA分析比較各組均數(shù)之間的差異。

2　結(jié)果

2.1 YXETNZ明顯提高OGD細(xì)胞的存活率應(yīng)用CCK-8試劑盒測定OGD 1、2、4、6、8、10 h時SHSY5Y細(xì)胞活力的結(jié)果顯示，與對照組相比，OGD 4 h組細(xì)胞存活率降低至54. 07%(Fig 2A)。隨著OGD時間的延長，SH-SY5Y細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，OGD 10 h后，細(xì)胞存活率只有18. 68%，由結(jié)果看出氧糖剝奪可明顯造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷，SHSY5Y細(xì)胞OGD 4 h為最佳氧糖剝離時間點。將細(xì)胞OGD 4 h，加入不同濃度藥物一起復(fù)氧1 h，結(jié)果顯示，YXETNZ可明顯提高OGD損傷細(xì)胞的存活率(Fig 2B)，且其保護(hù)作用隨濃度升高而升高，呈濃度依賴性，EC50值分別為2. 906、3. 251 mg·L－1，同時確定最佳給藥濃度為25 mg·L－1。

2.2 YXETNZ抑制OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡為了明確YXETNZ對細(xì)胞凋亡的抑制作用，本研究檢測了細(xì)胞凋亡指標(biāo)caspase-3/7酶活力和細(xì)胞質(zhì)histone-DNA復(fù)合小體含量。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞OGD損傷后，caspase-3/7酶活力和細(xì)胞質(zhì)中核小體含量明顯升高(Fig 3A、B)，YXETNZ可明顯降低caspase-3/7酶活力和抑制細(xì)胞核中核小體向細(xì)胞質(zhì)中釋放，抑制OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。

Fig 2　Effects of YXETNZ on improvement of the viabilities of SH-SY5Y cells damaged by OGD(±s，n =4)A: The cell viabilities of SH-SY5Y cells damaged by OGD for different times; B: Concentration-dependent improvement of cell viabilities of the OGD-induced SH-SY5Y cells treated with YXETNZ and JND.

2.3 YXETNZ激活A(yù)kt信號通路Akt信號通路是對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用的信號通路，本研究檢測了YXETNZ對此信號通路的影響。蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示，與OGD組相比，YXETNZ組磷酸化的Akt(Ser473)蛋白質(zhì)水平及下游磷酸化的Bad(Ser136)蛋白質(zhì)水平明顯升高，各組Akt總蛋白質(zhì)和Bad總蛋白質(zhì)無差異(Fig 4)。說明YXETNZ能通過活化Akt通路保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，并通過磷酸化下游的Bad蛋白質(zhì)抑制其活性，抑制細(xì)胞凋亡。

2.4 YXETNZ激活PKA信號通路本研究檢測了YXETNZ對PKA信號通路的影響。蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示，與OGD組相比，YXETNZ組中磷酸化PKA(Thr197)及PKA下游的磷酸化的Bad(Ser112)蛋白質(zhì)水平明顯升高，各組PKA總蛋白質(zhì)和Bad總蛋白質(zhì)無差異(Fig 5)。說明YXETNZ能通過活化PKA信號通路抑制凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

Fig 3　Effects of YXETNZ on inhibition of apoptosis of SH-SY5Y cells induced by OGD(±s，n =3)

3　討論

缺血性腦卒中是常見多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，約占腦卒中的60%～80%［7］，是世界范圍內(nèi)危害人 類健康的重要疾病之一。SH-SY5Y細(xì)胞的OGD模型是模擬缺血性腦卒中的經(jīng)典模型，已成為離體水平研究腦缺血損傷機(jī)制及藥物作用的重要手段。SH-SY5Y細(xì)胞OGD損傷后，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡水平明顯增加。YXETNZ可濃度依賴性地提高OGD損傷神經(jīng)細(xì)胞的活性，明顯降低OGD神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。JND是以銀杏萜類內(nèi)酯、銀杏黃酮類即銀杏葉提取物為主要成分的注射液，雖然銀杏黃酮可抑制腦缺血細(xì)胞凋亡［8］，但對于PI3K/Akt/Bad、PKA/Bad通路的活化，YXETNZ作用明顯優(yōu)于JND，這可能與其銀杏二萜內(nèi)酯含量高于JND有關(guān)。

Fig 4　Protein levels of the OGD-induced SH-SY5Y cells treated with YXETNZ(±s，n =3)A: Protein levels of p-Akt(Ser473)and p-Bad(ser136); B-C: The protein levels quantified by band gray-value ratio to actin; B: p-Akt(Ser473); C: p-Bad(Ser136).＊＊P＜0. 01 vs OGD group.

腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡主要通過外源性死亡受體通路、內(nèi)源性線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路進(jìn)行信號傳導(dǎo)［9］。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧糖剝奪時，線粒體ATP能量代謝障礙，線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C由線粒體內(nèi)膜釋放入細(xì)胞質(zhì)中［10］，并與Apaf-1、 procaspase-9蛋白形成復(fù)合物，此復(fù)合物促使procaspase-9從沒有活性的酶原轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)［11］，隨后caspase-9活化caspase-3執(zhí)行凋亡程序。研究表明Bad、Bcl-2、Bcl-xL等凋亡相關(guān)Bcl-2家族蛋白在腦缺血線粒體凋亡信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［9］。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺血損傷時，Bad由磷酸化的無活性狀態(tài)去磷酸化激活，并與14-3-3分子伴侶蛋白解離轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，與Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合抑制其的抗凋亡活性，促進(jìn)線粒體膜去極化，增強膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。當(dāng)Bad的Ser112、Ser136或Ser155殘基磷酸化時，就能與14-3-3蛋白形成復(fù)合物，抑制Bad與Bcl-2/BclxL結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞存活［13－14］。

Fig 5　Protein levels of the OGD-induced SH-SY5Y cells treated with YXETNZ(±s，n =3)A: Protein levels of p-PKA(Thr197)and p-Bad(Ser112); B-C: The protein levels quantified by band gray-value ratio to actin; B: p-PKA(Thr197); C: p-Bad(Ser112).*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs OGD group.

PI3K/Akt通路和PKA通路是機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞存活、凋亡、生長等多種生理功能的激酶傳導(dǎo)通路。研究報道活化的PI3K/Akt、PKA通路均可通過磷酸化Bad抑制腦卒中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡損傷［9，15］，Akt磷酸化Bad的Ser136殘基，PKA磷酸化Bad的Ser112和Ser155殘基［13，16－18］。由本研究結(jié)果看出，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可磷酸化激活OGD損傷SH-SY5Y細(xì)胞Akt和PKA激酶，分別促進(jìn)Bad(Ser136)、Bad(Ser112)磷酸化，通過調(diào)控線粒體凋亡途徑下調(diào)caspase-3/7酶活力促進(jìn)在腦缺血條件下神經(jīng)細(xì)胞的存活。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液激活PI3K/Akt/Bad/caspase-3/7和cAMP/PKA/Bad/caspase-3/7通路是其除了通過PAF受體拮抗抑制血栓形成之外，在缺血性腦卒中治療過程中發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。

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Neuroprotective effects of YXETNZ injection on SH-SY5Y cells against injury induced by oxygen-glucose deprivation

LIU Qiu，XU Zhi-liang，ZHOU Jun，LI Na，BI Yu-an，WANG Zhen-zhong，XIAO Wei
(State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd，Lianyungang Jiangsu 222001，China)

Abstract:Aim To investigate the protective effects of YXETNZ injection on SH-SY5Y cells damaged by oxygen-glucose deprivation(OGD)，and explore its functional mechanisms.Methods After 4 h of OGD， the cells were treated with 25 mg·L－1drugs for 1 h.Subsequently，cell viabilities were measured by cell counting kit-8(CCK-8 kit)and cell apoptosis was measured by caspase-3/7 assay kit according to manu-facturer’s instructions.Furthermore，cell death was also detected by ELISA.The levels of phospho-Akt，phospho-PKA，phospho-Bad were evaluated by western blot.Results Oxygen-glucose deprivation significantly decreased the cell viabilities of SH-SY5Y cells，while YXETNZ injection significantly increased cell viabilities，phospho-Akt，phospho-PKA and phospho-Bad.Furthermore，YXETNZ injection also reduced the activities of caspase-3/7 and cytoplasmic histone-associated-DNA-fragments contents.Conclusion Our researches demonstrat that YXETNZ injection shows good neuroprotective effects on SH-SY5Y cells after oxygenglucose deprivation.The underlying mechanisms may be associated with activation of PI3K/Akt/Bad/caspase-3/7，cAMP/PKA/Bad/caspase-3/7 signaling pathway.

Key words:YXETNZ injection; oxygen-glucose deprivation; apoptosis; PKA; Akt; Bad

基金項目:現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(No 2013ZX09402203);國家工信部重大科技成果轉(zhuǎn)化項目

作者簡介:劉秋(1988－)，女，碩士，助理研究員，研究方向:藥物分子藥理學(xué)，E-mail: l.q1988@163.com;

收稿日期:2015－02－20，修回日期:2015－04－02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0994－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.021