乙醇激活A(yù)LDH2對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響

李徽徽，于　影，賀文欣，周艷梅，柴繼俠(蚌埠醫(yī)學(xué)院.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，.生理學(xué)教研室，安徽蚌埠　33030)

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乙醇激活A(yù)LDH2對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響

李徽徽1，于影2，賀文欣1，周艷梅1，柴繼俠1
(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2.生理學(xué)教研室，安徽蚌埠233030)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R-332; R322.64; R587.1; R587.2; R977. 3

摘要:目的觀察乙醇激活乙醛脫氫酶2(ALDH2)對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響。方法健康♂SD大鼠高糖高脂飲食聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(STZ)(35 mg·kg－1)制備2型糖尿病大鼠模型。成模后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2型糖尿病組、乙醇+ 2型糖尿病組(n =6)。乙醇+ 2型糖尿病組大鼠先給予體積分?jǐn)?shù)0. 025乙醇喂養(yǎng)1周后，改用體積分?jǐn)?shù)0. 05乙醇繼續(xù)喂養(yǎng)7周;正常對(duì)照組和2型糖尿病組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)8周。8周后，測(cè)定血糖、糖化血紅蛋白、血清睪酮、睪丸質(zhì)量系數(shù)等指標(biāo)，觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)改變，檢測(cè)睪丸組織ALDH2 mRNA、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA水平和TGF-β1陽(yáng)性率的變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和睪丸質(zhì)量系數(shù)均明顯升高，血清睪酮水平明顯降低，睪丸組織中部分生精小管萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞減少，排列疏松，睪丸間質(zhì)細(xì)胞減少，睪丸組織ALDH2 mRNA水平明顯減少，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1陽(yáng)性率明顯升高。給予乙醇干預(yù)后，與2型糖尿病組比較，乙醇+ 2型糖尿病組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和睪丸質(zhì)量系數(shù)降低，血清睪酮水平升高，病理改變減輕，睪丸組織ALDH2 mRNA水平明顯升高、TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1陽(yáng)性率明顯降低。結(jié)論激活A(yù)LDH2可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，減輕2型糖尿病對(duì)睪丸的損傷。

關(guān)鍵詞:2型糖尿病;乙醛脫氫酶2;睪丸;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;乙醇;鏈脲佐菌素;大鼠

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.015.html

柴繼俠(1976－)女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)疾病和糖尿病的機(jī)制研究，Tel: 0552-3175282，E-mail: chaichai123456@163.com

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群，其中90%以上為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)［1］。糖尿病并發(fā)癥可涉及多種器官，隨著糖尿病發(fā)病率的升高及發(fā)病年齡的降低，糖尿病并發(fā)男性生殖功能障礙作為典型的并發(fā)癥之一倍受關(guān)注。

乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類(lèi)氧化酶，是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)因子之一，與生物氧化關(guān)系密切，廣泛分布于心臟、肝臟、腎臟和睪丸等組織中［2］。Murata等［3］觀察到少量或適量的外源性乙醇可以激活A(yù)LDH2的表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)觀察到激活A(yù)LDH2可以減輕糖尿病大鼠心肌損傷［4］，腎臟損傷［5］和肝臟損傷［6］。大量研究顯示，線粒體ALDH2具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用，但激活A(yù)LDH2是否對(duì)糖尿病大鼠的睪丸損傷有保護(hù)作用至今尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)低劑量乙醇激活A(yù)LDH2，觀察是否能在T2DM大鼠睪丸組織中發(fā)揮保護(hù)作用，為其臨床新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料4～5周齡清潔級(jí)♂SD大鼠18只，體質(zhì)量(100±10)g，蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào): 0005237，許可證號(hào): SCXK2009(蘇)－0001。

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;免疫組化SP試劑盒，小鼠抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。大鼠血清睪酮定量ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司; TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自MBI Fermentas公司; ALDH2、TGF-β1、β-actin引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1　The primer squences for each gene

1.2方法

1.2.1 T2DM模型制備及分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為T(mén)2DM模型組和正常對(duì)照組(NC組)。T2DM模型組大鼠每日給予高脂高糖乳劑灌胃，NC組大鼠每日給予生理鹽水灌胃。6周后，禁食12 h，T2DM模型組大鼠一次性腹腔注射新配制的STZ 35 mg·kg－1，分別于給藥72 h后和7 d后尾靜脈采血測(cè)血糖，以?xún)纱坞S機(jī)血糖≥16. 7 mmol·L－1確定為T(mén)2DM模型建立成功［7］; NC組大鼠給予等量枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。將T2DM模型組中造模成功的大鼠隨機(jī)分為2型糖尿病組(T2DM組)和乙醇+ 2型糖尿病組(EtOH + T2DM組)。EtOH + T2DM組大鼠先給予體積分?jǐn)?shù)為0. 025乙醇適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，改用體積分?jǐn)?shù)0. 05乙醇繼續(xù)喂養(yǎng)7周［5］; NC組和T2DM大鼠常規(guī)喂養(yǎng)8周。

3組大鼠干預(yù)8周后，清晨空腹稱(chēng)體重，采集大鼠血液及睪丸組織標(biāo)本，提前死亡的大鼠排除在外。

1.2.2空腹血糖及糖化血紅蛋白測(cè)定尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖(FBG)水平，水合氯醛麻醉后從右側(cè)頸總動(dòng)脈采血1. 5 mL，置于肝素抗凝管中，臺(tái)式離心機(jī)4℃，4 000 r·min－1離心5 min，分離紅細(xì)胞，測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.2.3血清睪酮測(cè)定右側(cè)頸總動(dòng)脈取血2 mL，臺(tái)式離心機(jī)4℃，3 000 r·min－1離心15 min后，收集血清，－80℃冰箱保存。ELISA檢測(cè)大鼠血清睪酮水平。

1.2.4睪丸組織病理學(xué)檢查大鼠處死后，速取睪丸并稱(chēng)重，計(jì)算睪丸質(zhì)量系數(shù)(睪丸重量/體重)。左側(cè)睪丸－80℃冰箱保存，后期做RT-PCR。右側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋，切成5 μm薄片，蘇木精伊紅染色。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平采用TRIzol一步提取左側(cè)睪丸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3 min后，以①95℃50 s變性，②β-actin退火溫度59. 4℃50 s; ALDH2退火溫度59. 8℃50 s; TGF-β1退火溫度58. 5℃50 s，③72℃60 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后一輪延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚蘭混勻，于15 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色。在GIS凝膠處理系統(tǒng)對(duì)凝膠圖像拍攝記錄，并使用圖像分析軟件掃描凝膠中每一擴(kuò)增條帶吸光度做半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的吸光度比值(ALDH2/β-actin，TGF-β1/β-actin)表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6免疫組化測(cè)定睪丸組織中TGF-β1的表達(dá)

睪丸組織切片脫蠟、水化，枸櫞酸鹽高溫修復(fù)抗原，過(guò)氧化氫封閉。加一抗，4℃過(guò)夜，二抗37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)、脫水、透明、封片。高倍顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，生精小管的細(xì)胞中出現(xiàn)TGF-β1棕色顆粒的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比為T(mén)GF-β1陽(yáng)性率。

2　結(jié)果

除NC組外，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠均出現(xiàn)多食、多飲、多尿、消瘦等癥狀。

2.1各組大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠FBG和HbA1c明顯升高(P ＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠FBG和HbA1c水平降低(P＜0. 05，Tab 2)。

Tab 2　Levels of fasting blood glucose(FBG)and glycosylated hemoglobin(HbA1c)in different groups(±s，n =6)

2.2各組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)(TW/BW)、血清睪酮的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)升高，血清睪酮明顯降低(P＜0. 05～P＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)降低，血清睪酮升高(P＜0. 05，Tab 3)。

Tab 3　Ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and level of testosterone in different groups(±s，n =6)

2.3各組大鼠睪丸組織病理學(xué)改變NC組大鼠睪丸組織中生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞豐富，排列有序，多為6～7層，管腔中有大量的精子。T2DM組大鼠睪丸組織中生精小管萎縮，生精細(xì)胞數(shù)量少，排列紊亂，多為2～3層。EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞較T2DM組明顯增多，細(xì)胞排列較為有序，管腔中有少量精子(Fig 1)。

Fig 1　Seminiferous tubules of different groups(HE×400)A: Seminiferous tubules of rats in NC; B: Seminiferous tubules of rats in T2DM; C: Seminiferous tubules of rats in EtOH + T2DM

2.4各組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯降低，TGF-β1 mRNA水平明顯升高(P ＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，TGF-β1 mRNA水平明顯降低(P＜0. 01，F(xiàn)ig 2、3)。

Fig 2　Expression of ALDH2 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

Fig 3　Expression of TGF-β1 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0.01 vs T2DM

2.5各組大鼠睪丸組織中TGF-β1表達(dá)的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1陽(yáng)性率明顯升高(P＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1陽(yáng)性率明顯降低(P＜0. 01，F(xiàn)ig 4)。

Fig 4　Expression of TGF-β1(A)and positive rate of TGF-β1(B)in testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

3　討論

糖尿病作為一種慢性進(jìn)行性?xún)?nèi)分泌病及代謝性病，主要表現(xiàn)為其復(fù)雜的并發(fā)癥對(duì)身體健康造成嚴(yán)重的危害，生殖系統(tǒng)損傷是其慢性并發(fā)癥之一。目前，人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證明，2型糖尿病對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響以睪丸的組織形態(tài)、生精功能和性激素水平的變化為主要表現(xiàn)。本研究通過(guò)高糖高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ制備2型糖尿病大鼠模型，通過(guò)長(zhǎng)期大量高糖、高脂飲食造成大鼠胰島素抵抗，聯(lián)合STZ，高度選擇性破壞動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致2型糖尿病形成［8］。造模后，大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀，大鼠FBG、HbA1c和睪丸質(zhì)量系數(shù)均明顯升高，大鼠睪丸體積縮小，血清睪酮水平明顯降低，睪丸組織中部分生精小管萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞減少，排列疏松，并有晚期長(zhǎng)形精子細(xì)胞滯留現(xiàn)象，睪丸間質(zhì)中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞相對(duì)較少，與2型糖尿病患者的癥狀較一致，說(shuō)明造模成功。

目前認(rèn)為，糖尿病的高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。有研究表明，糖尿病并發(fā)生殖系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡，生精能力減弱、睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮能力下降等均與氧化應(yīng)激有關(guān)。ALDH2作為體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)因子之一，與生物氧化關(guān)系密切。Ohta等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2活性缺失型PC12細(xì)胞更容易受到脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷，且細(xì)胞存活率低。Weng等［10］發(fā)現(xiàn)ALDH2基因敲除的小鼠更容易受乙基叔丁基醚影響，造成生殖系統(tǒng)損傷。本研究觀察到2型糖尿病大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯降低，并與睪丸組織結(jié)構(gòu)的損傷、血清睪酮的減少相關(guān)并呈依賴(lài)性。提示糖尿病引起的生殖系統(tǒng)損傷可能與睪丸組織中ALDH2降低有關(guān)。對(duì)2型糖尿病大鼠給予ALDH2激活劑低劑量乙醇干預(yù)8周后，觀察到大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，F(xiàn)BG、HbA1c和睪丸質(zhì)量系數(shù)降低，血清睪酮水平升高，睪丸組織中生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞較T2DM組明顯增多，提示激活A(yù)LDH2可改善糖尿病大鼠生殖系統(tǒng)的損傷。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種細(xì)胞分泌的具有免疫抑制作用的負(fù)調(diào)控因子［11］，在睪丸內(nèi)多數(shù)細(xì)胞(包括睪丸支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、肌樣細(xì)胞及生精細(xì)胞)均有表達(dá)。睪丸中TGF-β1主要由支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌，通過(guò)自分泌和旁分泌作用，調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的類(lèi)固醇合成和增殖［12－14］，以及誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡［15］。多項(xiàng)研究證明，哺乳動(dòng)物的TGF-β1對(duì)精子的產(chǎn)生和發(fā)育起調(diào)控作用［16］。糖尿病病程中，高血糖可刺激TGF-β1的大量表達(dá)［17］。TGF-β1過(guò)表達(dá)可以抑制睪丸的生精作用，促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表達(dá)較NC組明顯增高，并與睪丸組織結(jié)構(gòu)的損傷、血清睪酮的減少相關(guān)，并呈依賴(lài)性。因此，下調(diào)睪丸TGF-β1表達(dá)將有助于減輕2型糖尿病并發(fā)生殖系統(tǒng)損傷。對(duì)2型糖尿病大鼠給予ALDH2激活劑低劑量乙醇干預(yù)8周后，大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表達(dá)較T2DM組明顯降低，睪丸組織結(jié)構(gòu)和血清睪酮明顯改善，提示激活A(yù)LDH2可能通過(guò)對(duì)抗睪丸組織氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)睪丸組織中TGF-β1的表達(dá)，發(fā)揮睪丸保護(hù)作用。

因此我們得出結(jié)論，糖尿病大鼠睪丸組織中TGF-β1表達(dá)升高，而低劑量乙醇激活A(yù)LDH2可以下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而減輕睪丸的損傷。ALDH2是如何調(diào)控TGF-β1的表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。隨著研究的逐步深入，利用低劑量乙醇干預(yù)或其他干預(yù)激活A(yù)LDH2，有望為臨床上預(yù)防、治療糖尿病生殖系統(tǒng)損傷提供新的思路。

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Effects of activation of ALDH2 by ethanol in testis injury of type 2 diabetic rats

LI Hui-hui1，YU Ying2，HE Wen-xin1，ZHOU Yan-mei1，CHAI Ji-xia1
(1.Dept of Histology and Embryology; 2.Dept of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China)

Abstract:Aim To observe the effects of activation of aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)by ethanol on testis injury of type 2 diabetic rats.Methods Type 2 diabetic rats model were established by high-fat diet combined with low-dose streptozotocin(STZ)injections.After the success of modeling，the rats were randomly divided into 3 groups(n = 6): normal control group(NC)，type 2 diabetes group(T2DM)and ethanol + type 2 diabetes group(EtOH + T2DM).Rats of EtOH + T2DM were treated with low-dose ethanol，then rats of NC and T2DM were given normal diet for 8 weeks.After 8 weeks，the levels of the fasting blood glucose(FBG)，glycosylated hemoglobin(HbA1c)and testosterone were tested，and the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)was calculated.Morphological changes of testis tissue were observed by optical microscope.The levels of ALDH2 mRNA and transforming growth factor β1(TGF-β1)mRNA in testis tissue were measured.The expression of TGF-β1 in testis tissue was observed by immunohistochemical staining，then the positive rate of TGF-β1 was calculated.

Results Compared with NC，the levels of FBG， HbA1c and TW/BW increased significantly and the level of testosterone decreased significantly in T2DM.The morphological observation showed that some seminiferous tubules atrophied，spermatogenic cells decreased and arrangemented loosely，Leydig cells decreased in testicular interstitial.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue decreased significantly，and the level of TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue increased significantly.However，compared with T2DM，the levels of FBG，HbA1c and TW/BW decreased，and the level of testosterone increased and the damage of testis tissue was attenuated in EtOH + T2DM.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue increased significantly，and the level TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue decreased significantly.Conclusion Activating ALDH2 can protect testis in type 2 diabetic rats，which may be related to the downregulation of TGF-β1 expression.

Key words:type 2 diabetes mellitus; aldehyde dehydrogenase 2; testis; transforming growth factor β1; ethanol; streptozotocin; rats

作者簡(jiǎn)介:李徽徽(1981－)，女，碩士，講師，研究方向:干細(xì)胞與組織工程，Tel:0552-3175282，E-mail: dearlxh@163.com;

基金項(xiàng)目:高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No KJ2014A166);安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No KJ2015B013by);蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究資助重點(diǎn)項(xiàng)目(No BYKL1402ZD);蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No Byky1213)

收稿日期:2015－03－07，修回日期:2015－04－10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0962－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.015