紫外線對(duì)煙青蟲血細(xì)胞數(shù)及SOD活性的影響

張海玲， 周正湘

(安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 貴州 安順 561000)

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紫外線對(duì)煙青蟲血細(xì)胞數(shù)及SOD活性的影響

張海玲， 周正湘

(安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 貴州 安順 561000)

為探索物理技術(shù)防治煙青蟲的應(yīng)用前景，采用不同處理時(shí)間(1 h，3 h，6 h，9 h，12 h)紫外線照射處理， 對(duì)煙青蟲血細(xì)胞數(shù)和血漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明：隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，煙青蟲的血細(xì)胞數(shù)和血漿中SOD酶活性均呈先升高再降低的變化。5個(gè)處理的血細(xì)胞數(shù)分別較對(duì)照提高8.4%、10.2%、17.7%、6.5%和1.4%，且處理間存在極顯著差異(p<0.01)；5個(gè)處理的SOD酶活性分別為對(duì)照的1.2倍、2.4倍、4.5倍、3.0倍和1.5倍。當(dāng)紫外線照射6 h時(shí)，血細(xì)胞總量和SOD酶活性均達(dá)最高；照射12 h時(shí)二者幾乎恢復(fù)至對(duì)照水平。結(jié)論，紫外光刺激促進(jìn)了煙青蟲血細(xì)胞的增長(zhǎng)和SOD酶活性的升高，紫外照射6 h達(dá)最高。

煙青蟲； 紫外線； 血細(xì)胞； 超氧化物歧化酶

紫外線作為一種高能射線可對(duì)生物產(chǎn)生巨大影響。紫外光刺激能夠誘導(dǎo)高等動(dòng)物的免疫機(jī)制[1]，引起昆蟲體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[2-3]，導(dǎo)致昆蟲的生理行為及生化指標(biāo)發(fā)生變化。昆蟲體內(nèi)存在超氧化物歧化酶(SOD)[4]，其在細(xì)胞分化、減輕外來(lái)輻射對(duì)細(xì)胞的傷害，及在改變細(xì)胞周期方面有一定的作用。有研究報(bào)道，昆蟲體內(nèi)的SOD酶活性在受到紫外線[5]、高溫[6]和殺蟲劑[7-8]等的影響時(shí)可發(fā)生顯著變化。王智健等[9]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射棉鈴蟲1～4 h，雌蟲的產(chǎn)卵量顯著增加。張長(zhǎng)禹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線照射，棉鈴蟲體內(nèi)保幼激素隨著日齡的變化而發(fā)生顯著改變。鄭俊麗[11]研究發(fā)現(xiàn)，在紫外光的刺激下，黑腹果蠅的產(chǎn)卵量和壽命都明顯高于對(duì)照組。孟建玉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射能夠改變昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶活性，對(duì)蛋白質(zhì)造成氧化損傷，使蛋白質(zhì)生物活性喪失。

煙青蟲(Helicoverpaassulta)屬鱗翅目夜蛾科，又名煙草夜蛾，與棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[13]親緣關(guān)系極近，均為我國(guó)重要的農(nóng)作物害蟲，主要危害煙草、辣椒[14]和番茄等作物。貴州省是煙草生產(chǎn)的主要省份之一，對(duì)煙青蟲的防治工作極為重視。目前，防治煙青蟲主要是采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行治理，嚴(yán)重污染環(huán)境。采用紫外線輻射防治的研究還鮮有報(bào)道，且紫外線照射對(duì)煙青蟲血細(xì)胞及體內(nèi)SOD酶活性有什么影響目前還不清楚。為此，筆者于2014年通過采用紫外線照射煙青蟲，以期探索煙青蟲血細(xì)胞和SOD酶活性的變化，為研究煙青蟲的免疫機(jī)制，以及開發(fā)新型的煙青蟲生物防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙青蟲為4齡幼蟲，采自貴州省安順市。

試劑為PBS溶液，NaH2PO410 mM，NaCl 140 mM，KCl 27 mM，KH2PO41.8 mM，pH 6.5。Giemsa儲(chǔ)備液(Giemsa粉 3.8 g+甘油250 mL+甲醇250 mL混勻)入棕色瓶保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用PBS稀釋10倍。SOD測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用波長(zhǎng)256 nm，功率8 w的紫外燈照射煙青蟲。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，即紫外線分別照射1 h(T1)、3 h(T2)、6 h(T3)、9 h(T4)和12 h(T5)，以不照射處理為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理30頭幼蟲。蟲體距離燈管35 cm，照射后在恒溫(26±1)℃、 相對(duì)濕度70%～80%、 光周期L∶D=10 h∶14 h的條件下培養(yǎng)。對(duì)照組煙青蟲在相同環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 煙青蟲血細(xì)胞數(shù)和血漿SOD活性的測(cè)定

分別采集各處理煙青蟲4齡幼蟲的血淋巴65 μL，與經(jīng)苯基硫脲飽和過的等量PBS混合，待血細(xì)胞和血漿分離后，取7.5 μL血細(xì)胞用于細(xì)胞計(jì)數(shù)板。3次重復(fù)，數(shù)據(jù)取平均值。對(duì)照組方法同上。

使用南京建成生物工程研究所配制的SOD酶活性測(cè)定試劑盒對(duì)方法1.2中分離得到的血漿中SOD酶活性進(jìn)行測(cè)定，3次重復(fù)，取平均值。測(cè)得結(jié)果代入公式計(jì)算SOD酶活性(U/mL)。

SOD酶活性=(對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度)÷對(duì)照管吸光度÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

選用Spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線照射處理煙青蟲的血細(xì)胞數(shù)

從圖示看出，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，煙青蟲的血細(xì)胞數(shù)呈先升高再下降的趨勢(shì)，各處理的血細(xì)胞數(shù)從高到低依次為T3>T2>T1>T4>T5>CK。其中，紫外線照射處理1 h后，煙青蟲的血細(xì)胞數(shù)為58.0萬(wàn)個(gè)/μL，已明顯高于CK(為53.7萬(wàn)個(gè)/μL)；當(dāng)處理3 h時(shí)，血細(xì)胞數(shù)仍然呈上升趨勢(shì)，為59.0萬(wàn)個(gè)/μL；當(dāng)處理6 h時(shí)，血細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，為63.0萬(wàn)個(gè)/μL；當(dāng)處理9 h時(shí)，血細(xì)胞數(shù)開始下降，為57.0萬(wàn)個(gè)/μL，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，血細(xì)胞數(shù)繼續(xù)下降，當(dāng)處理12 h時(shí)，其血細(xì)胞數(shù)為54.3萬(wàn)個(gè)/μL，基本恢復(fù)正常值。5個(gè)處理的血細(xì)胞數(shù)比CK分別提高17.7%、10.2%、8.4%、6.5%和1.4%；5個(gè)處理間存在極顯著(p<0.01)和顯著差異(p<0.05)。其中，T1與T3、T2和T5、T3與T4的差異極顯著(p<0.01)，T3與T2差異顯著，T1與T5差異顯著(p<0.05)。

圖示 紫外線照射處理煙青蟲的血細(xì)胞數(shù)和SOD酶活性

Fig.Number of larval circulating hemocytes and SOD activity romH.assultaunder UV irradiation

2.2 紫外線照射處理煙青蟲的SOD酶活性

從圖示還看出，紫外線照射可提高煙青蟲血漿中的SOD酶活性，隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)，煙青蟲的SOD酶活性呈先升高再下降的趨勢(shì)，各處理的SOD酶活性從高到低依次為T3>T4>T2>T5>T1>CK。與CK相比，各照射處理煙青蟲的SOD酶活性明顯升高，分別是CK的4.5倍、3倍、2.4倍、1.5倍和1.2倍。其中，當(dāng)處理達(dá)6 h時(shí)，SOD酶活性達(dá)到峰值，為0.045 U/mL，較CK提高3.5倍；但隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶活性呈下降趨勢(shì)，當(dāng)處理達(dá)12 h時(shí)，SOD酶活性幾乎和正常值相同。5個(gè)照射處理間存在極顯著(p<0.01)和顯著差異(p<0.05)。其中，T1與T3、T3和T5差異極顯著(p<0.01)，T1與T4、T2與T3、T3和T4差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

紫外光刺激促進(jìn)了煙青蟲血細(xì)胞的增長(zhǎng)和SOD酶活性的升高，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，提高了機(jī)體的免疫力。其中，在紫外線照射達(dá)6 h時(shí)，血細(xì)胞總量和SOD酶活性達(dá)最高。但隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，血細(xì)胞數(shù)開始下降。表明，紫外線的刺激對(duì)血細(xì)胞的生長(zhǎng)分化造成了一定的影響。說明，細(xì)胞免疫作為昆蟲先天免疫的一種免疫方式，在抵抗外界不良環(huán)境時(shí)發(fā)揮著重要的作用。但具體的免疫機(jī)理還不清楚。在昆蟲免疫過程中，細(xì)胞免疫與體液免疫、黑化作用等免疫方式是否同時(shí)進(jìn)行，其間又是如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的等一系列問題仍需進(jìn)一步探索和研究。

當(dāng)紫外線照射煙青蟲時(shí)，5個(gè)處理的SOD酶活性分別是CK的1.2倍、2.4倍、4.5倍、3倍和1.5倍。在紫外線照射1 h時(shí)，煙青蟲體內(nèi)SOD酶活性明顯高于CK，此變化與紫外線照射黑腹果蠅[11]和斜紋夜蛾[15]是一樣的；而Meng[3，16]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射棉鈴蟲30 min時(shí)，其SOD酶活性已顯著升高，且照射時(shí)間延長(zhǎng)至1～1.5 h時(shí)，其SOD酶活性基本恢復(fù)正常值。這可能是由于紫外光強(qiáng)度不同所引起的。在紫外線照射的最初幾小時(shí)內(nèi)，其體內(nèi)血漿中SOD酶活性呈上升趨勢(shì)，但隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶活性開始下降，這種變化趨勢(shì)與續(xù)惠云[17]、代君君[18]的研究結(jié)果相同。說明，鱗翅目昆蟲在抵抗外界不良環(huán)境時(shí)，其SOD酶在生物體應(yīng)激反應(yīng)中具有共同的抗氧化機(jī)制。當(dāng)紫外線照射6 h時(shí)，SOD酶活性達(dá)最高，此結(jié)果與宋林霞[19]的研究一致，其原因可能是由于SOD酶在不同生物體內(nèi)具有共同的抗氧化機(jī)制造成。6 h之后，SOD酶活性開始下降；而在紫外線照射水螅[20]16 h后，SOD酶活性才開始下降。這可能是由于腔腸動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物在遭受紫外脅迫時(shí)所啟動(dòng)的抗氧化酶系不同。不同動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶系的作用不一樣，其間的差異性還需深入研究。

[1] Department of Immunology and the Center for Cancer Immunology Research,The University of Texas M D.Anderson Cancer Center,Houston, Texas,USA.Inhibition of photocarcinogenesis by platelet-activating factor or serotonin receptor antagonists[J].Cancer Research,2008,68(10):3978-3984.

[2] Sachdev B,Zarin M,Khan Z,et al.Effect of gamma radiation on Phenoloxidase pathway,antioxidant defense mechanism inHelicoverpaarmigera(Lepidoptera: Noctuidae) and its implication in inherited sterility towards pest suppression[J].Int J Radiat Biol,2014,90(1):7-19.

[3] Meng J Y,Zhang C Y,Zhu F, et al.Ultraviolet light-induced oxidative stress: effects on antioxidant response ofHelicoverpaarmigeraadults[J].J Insect Physiol,2009,55(6):588-592.

[4] 董 亮，何永志，王遠(yuǎn)亮，等.超氧化物歧化酶(SOD)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)導(dǎo)報(bào)，2013(5):53-58.

[5] Wang Y, Wang L,Zhu Z, et al.The molecular characterization of antioxidant enzyme genes inHelicoverpaarmigeraadults and their involvement in response to ultraviolet-A stress[J].J Insect Physiol, 2012,58(9):1250-1258.

[6] Li H B,Zheng Y T,Sun D D,et al. Combined effects of temperature and avermectins on life history and stress response of the western flower thrips,Frankliniellaoccidentalis[J]. Pestic Biochem Physiol,2014,108:42-48.

[7] Mishra M,Sharma A, Shukla A K,et al.Genotoxicity of dichlorvos in strains ofDrosophilamelanogasterdefective in DNA repair[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2014,766:35-41.

[8] Mehdi S H,Qamar A. Paraquat-induced ultrastructural changes and DNA damage in the nervous system is mediated via oxidative-stress-induced cytotoxicity inDrosophilamelanogaster[J].Toxicol Sci,2013,134(2):355-365.

[9] 王智健，牛長(zhǎng)纓.UV照射對(duì)棉鈴蟲產(chǎn)卵量及HMG-CoA還原酶和卵黃原蛋白基因表達(dá)量的影響[J]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33(2):46-50.

[10] 張長(zhǎng)禹，孟建玉，周麗君，等.紫外脅迫對(duì)棉鈴蟲成蟲保幼激素的影響[J].植物保護(hù)，2012(6):72-76.

[11] 鄭俊麗.UVA照射對(duì)黑腹果蠅生物學(xué)特性和抗氧化反應(yīng)的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[12] 孟建玉，張長(zhǎng)禹，雷朝亮.紫外線照射對(duì)棉鈴蟲成蟲幾種同工酶的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,31(1)：69-72.

[13] Jiang X J,Guo H, Di C,et al. Sequence similarity and functional comparisons of pheromone receptor orthologs in two closely relatedHelicoverpaspecies[J].Insect Biochem Mol Biol,2014,48:63-74.

[14] Ahn SJ,Badenes-P rez FR,Heckel DG. A host-plant specialist,Helicoverpaassulta, is more tolerant to capsaicin fromCapsicumannuumthan other noctuid species[J].J Insect Physiol,2011,57(9):1212-1219.

[15] Karthi S,Sankari R,Shivakumar M S.Ultraviolet-B light induced oxidative stress:effects on antioxidant response ofSpodopteralitura[J].J Photochem Photobiol B,2014,135:1-6.

[16] 孟建玉.UV脅迫下棉鈴蟲生理生化響應(yīng)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[17] 續(xù)惠云，羅明志，孟 芮，等.(12)C～(6+)離子輻射對(duì)細(xì)胞存活增殖及模擬失重和輻射對(duì)家蠶卵發(fā)育的影響[J]．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,29(17):1551-1554.

[18] 代君君，范 濤，周業(yè)奉，等.6Co-γ射線輻射對(duì)家蠶抗菌肽誘導(dǎo)效應(yīng)研究[J].中國(guó)蠶業(yè)，2010,31(1):22-25.

[19] 宋林霞，徐振彪.紫外線對(duì)日本三角渦蟲切割損傷前后超氧化物歧化酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(21):11049-11112.

[20] 方 芳，喬淑晶，陳 瑛，等.紫外線輻射對(duì)水螅三種保護(hù)酶活性的影響[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2006,22(6):83-85.

(責(zé)任編輯： 王 海)

Influence of Ultraviolet on the Number of Haemocytes and Superoxide Dismutase Activity fromHelicoverpaassulta

ZHANG Hailing, ZHOU Zhengxiang

(AgricultureInstituteofAnshunUniversity,Anshun,Guizhou556100,China)

To explore the application prospects of physical technology in controllingH.assulta, the variation of the number of haemocytes and SOD activity ofH.assultawere studied, which was exposed to ultraviolet for various duration(1 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h). Results: There was a significant difference among the five experimental groups(p<0.01). And the number of the haemocytes and the SOD activity first increased and then decreased with the extension of irradiation time. The number of the haemocytes increased by 8.4 %, 10.2%, 17.7%, 6.5% and 1.4% compared with the control group, respectively. The activity of the SOD in the experimental group was 1.2 times, 2.4 times, 4.5 times, 3.0 times and 1.5 times as high as the control group, separately. The amount of total haemocytes and the SOD activity both reached the highest at 6 h; however, both returned to the control level at 12 h. The experimental results showed that UV light stimulation promoted the haemocytes growth and the SOD activity, and reached the highest at 6 h.

Helicoverpaassulta; ultraviolet; haemocyte; SOD

2014-10-14； 2015-04-13修回

貴州省科技廳、安順市人民政府與安順學(xué)院聯(lián)合科技基金資助項(xiàng)目“煙青蟲免疫相關(guān)基因克隆及功能分析” [黔科合J字LKA(2013)02]

張海玲(1984-)，女，講師，碩士，從事昆蟲發(fā)育與免疫研究。E-mail：1152909453@qq.com

1001-3601(2015)05-0247-0098-03

S477+.4

A