濃香型大曲中1株高液化力功能細菌的篩選與鑒定

陳曉旭， 明紅梅*， 羅惠波， 許德富， 朱莉莉， 姚 霞， 薛登文

(1.四川理工學院 生物工程學院， 四川 自貢 643000； 2.瀘州老窖股份有限公司， 四川 瀘州 646000)

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濃香型大曲中1株高液化力功能細菌的篩選與鑒定

陳曉旭1， 明紅梅1*， 羅惠波1， 許德富2， 朱莉莉1， 姚 霞1， 薛登文1

(1.四川理工學院 生物工程學院， 四川 自貢 643000； 2.瀘州老窖股份有限公司， 四川 瀘州 646000)

為探尋大曲微生物與風味物質(zhì)之間的相關性，為構(gòu)建大曲功能菌群及實現(xiàn)制曲生產(chǎn)異地化奠定基礎，采用平板篩選、固態(tài)發(fā)酵、16S rDNA鑒定及HS-SPME-GC-MS等方法對濃香型大曲中的高液化力菌株進行篩選與鑒定。結(jié)果表明：菌株X20與枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性高達99%，可確定其為枯草芽孢桿菌；該菌株的液化力高達11.756 g/(g·h)，其代謝產(chǎn)物含有吡嗪類物質(zhì)、愈創(chuàng)木酚和苯甲醛等多種重要的大曲風味物質(zhì)，可初步確定其為大曲的功能菌株。

濃香型大曲； 高液化力； 細菌； 功能菌株； HS-SPME-GC-MS； 16S rDNA

濃香型白酒具有窖香濃郁、綿甜爽洌、香味協(xié)調(diào)、尾凈味長等特點[1]而廣受大眾喜愛。曲為酒之骨，有好酒必有好曲。大曲中的微生物大體可分為細菌、霉菌和酵母菌三大類[2]，其在曲塊上生長、繁殖、代謝產(chǎn)生各種酶系，使大曲具有液化、糖化和蛋白質(zhì)分解等能力，該功能特性指標也是大曲培養(yǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵所在[3]。

大曲中的細菌具有水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力，有的細菌能代謝產(chǎn)生酒中的芳香成分前體物質(zhì)乙偶姻、二乙酰等[4]。楊帆等[5]對茅臺大曲中芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物進行比對分析發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物中含有大曲重要的風味物質(zhì)且濃度較高。大曲淀粉水解酶中液化酶是影響白酒產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[6]，細菌的液化力是指大曲中多種酶對淀粉水解的綜合能力，主要是α-淀粉酶的作用。α-淀粉酶能首先將淀粉分解為糊精、少量麥芽糖等，然后其他淀粉酶進一步將其水解，促進大曲的糖化[7]，進而形成大曲中眾多的風味成分。

目前，濃香型大曲微生物的研究主要集中在優(yōu)良菌種的篩選、鑒定和應用于強化大曲[8-10]等方面，而對于大曲微生物與風味物質(zhì)之間相關性研究較少。為此，筆者采用平板透明圈初篩和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)酶分析，結(jié)合檢測揮發(fā)性代謝產(chǎn)物等方法，對中高溫濃香型大曲中的細菌進行篩選，初步探尋大曲微生物與風味物質(zhì)之間的聯(lián)系，以期篩選出高液化力的制曲功能菌株，構(gòu)建大曲的功能菌群，使大曲的生產(chǎn)發(fā)酵過程簡單化，為制曲生產(chǎn)異地化再現(xiàn)提供條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大曲 由瀘州老窖制曲生態(tài)園提供。

1.1.2 儀器與設備 RT-34型靜音研磨粉碎機，北京環(huán)亞天元機械技術有限公司；MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海和羽電子科技有限公司；TW-200W型可控調(diào)溫電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國Supelco 公司；手動SPME進樣器，美國Supelco公司；Agligent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；毛細管色譜柱為DB-WAX，規(guī)格為(60 m×250 μm×0.25 μm)。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂17.5 g/L，pH 7.4～7.6，121℃滅菌30 min。α-淀粉酶篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，可溶性淀粉20 g/L，瓊脂17.5 g/L，121℃滅菌30 min。小麥固體培養(yǎng)基：每80 g小麥粉分裝于250 mL錐形瓶，調(diào)節(jié)小麥原料含水36%左右， 121℃滅菌20 min。

1.2 濃香型大曲高液化力細菌的篩選

無菌條件下取約15 g大曲樣品放入研缽中，待樣品充分分散后無菌稱取10 g樣品放入裝有90 mL無菌水的滅菌三角瓶，置于搖床(37℃，200 r/min)震蕩30 min，然后逐步稀釋至10―7。選取10―5、10―6和10―73個稀釋度，各吸取150 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行，將涂布后的平板倒置于37℃下培養(yǎng)24 h，挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進一步純化培養(yǎng)，直至形成單菌落的細菌菌株再接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 濃香型大曲高液化力細菌的平板初篩

將斜面保藏的細菌菌株活化后點接到α-淀粉酶篩選培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。取出后滴碘液于培養(yǎng)好的平板上，使碘液覆蓋整個平板，待顯色后觀察水解透明圈的大小并用游標卡尺測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，計算兩者比值(H/C)，通過比值的大小初步篩選出能產(chǎn)α-淀粉酶的菌株。比值越大，說明該菌株產(chǎn)α-淀粉酶的能力較強。

1.4 高液化力細菌的固態(tài)發(fā)酵

無菌操作條件下，用移液槍將產(chǎn)α-淀粉酶優(yōu)良菌株的種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種到裝有80 g小麥固體培養(yǎng)基的三角瓶中并拌勻，用八層紗布封口，將接種好的小麥培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h，中間間歇手工震蕩，發(fā)酵結(jié)束后檢測所接優(yōu)良菌株(X20，X8，X2，X19，X11)的液化力指標。

1.5 細菌液化力的測定

1) 稱取相當于10.0 g絕干的細菌固態(tài)發(fā)酵試樣，加20 mL pH4.6的醋酸鈉緩沖溶液，用水調(diào)至總體積200 mL，充分攪拌。將裝有試樣的燒杯置于35℃恒溫水浴鍋中保溫浸漬1 h，過濾取濾液，制得5%試樣酶液備用。

2) 吸取20 mL淀粉溶液(20 g/L)于150 mL錐形瓶中，加入5 mL pH4.6的醋酸鈉緩沖溶液搖勻，于水浴中預熱至試液為35℃時，加入10 mL 5%試樣酶液充分搖勻并立即記時，用膠頭滴管吸取反應液2～3滴滴入預先滴有1滴碘液的白瓷盤中進行呈色反應，直至試液不變色(碘液本色)為終點，記下反應時間[11]。

1.6 HS-SPME-GC-MS法測定細菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)

將固相微萃取裝置的萃取頭在氣相色譜的進樣口老化，溫度為250℃，時間為15 min。稱取5 g發(fā)酵產(chǎn)物于15 mL裝樣瓶中，在60℃條件下平衡15 min。將固相微萃取器的萃取頭插入裝樣瓶，吸附30 min后縮回纖維頭，再插入GC-MS中檢測發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)。

GC-MS操作條件：最高溫度230℃，程序升溫；進樣量1 μL，進樣方式為手動不分流，進樣口溫度為230℃；質(zhì)譜電離源EI；采集方式為全掃描；容積延遲3 min；離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃；增益系數(shù)1。

1.7 細菌菌株分子生物學(16S rDNA)鑒定

引物：27F∶5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R∶5’-TACGGYTACCTTGTTACG-3’，由上海英濰捷基合成。PCR反應體系(50 μL)：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL， Mg2+3 μL，引物2 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 34 μL，模板1 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循環(huán)30次。4℃保存。

基因測序由上海杰李公司完成，采用DNAstar將測序結(jié)果進行序列拼接和去除多余堿基后，登陸NCBI進行BLAST分析，采用MEGA6進行發(fā)育樹構(gòu)建，重復取樣1 000次進行bootstrap。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型大曲中高液化力細菌的初篩

菌株X11、X20碘液顯色結(jié)果如圖1所示，菌株X11周圍的透明圈較小，菌株X20周圍的透明圈明顯較大。從表可見，篩選出的20株細菌中菌株X20、X8、X2、X19和X11的H/C較大，說明該5株細菌的液化能力較強。其中，菌株X20的H/C最大，為1.76；X11的H/C最小，為1.34；5株細菌H/C比值的排序為X20>X2>X8>X19>X11。平板比值可初步體現(xiàn)菌株液化力高低，液化力大小還需通過進一步測定。

圖 1 液化力細菌的碘液顯色反應

Fig.1 Chromogenic reaction of bacteria liquefying power

表 液化力細菌的平板初篩

Table Results of liquefying power preliminary screening

菌種號StrainNo.水解透明圈直徑/mmH菌落直徑/mmC透明圈與菌落直徑比H/CX2017.29.81.76X815.010.01.50X29.46.11.54X1911.28.11.38X1111.58.61.34

2.2 細菌液化力的測定

選取初篩結(jié)果中H/C比值較大的X20、X8、X2、X19和X11細菌菌株進行固態(tài)發(fā)酵，并對其發(fā)酵產(chǎn)物的液化力進行定量測定(重復5次測定值)的結(jié)果表明，菌株的液化力依次為X20>X19>X2>X8>X11。其中，菌株X20的液化力最高，為(11.756±0.15)g/(g·h)；其次是菌株X19，其液化力為(0.817±0.10)g/(g·h)；菌株X2、X8和X11的液化力分別為(0.496±0.47)g/(g·h)、(0.468±0.23)g/(g·h)和(0.407±0.36)g/(g·h)。由方差分析可知，菌株X20、X8、X2、X19和X11的液化力之間差異均顯著，固態(tài)發(fā)酵結(jié)果與液化力細菌的平板初篩結(jié)果基本一致，其液化力均高于傳統(tǒng)大曲質(zhì)量指標認定的質(zhì)量上乘標準[≥0.5 g/(g· h)][12]。因此，選取液化力最高的菌株X20進行后續(xù)試驗。

2.3 菌株X20發(fā)酵產(chǎn)物的GS-MS分析

從圖2可見，菌株X20的發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測到揮發(fā)性風味物質(zhì)14種，主要包括吡嗪類、酚類、醇類和醛類等。吡嗪類物質(zhì)一般都具有烘焙和堅果香[13]，醇類、醛類均會產(chǎn)生使人愉快的氣味，有些醛、醇本身還具有花草和水果的香氣，這些風味成分對濃香型大曲復合曲香的形成有一定的貢獻[14]。發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到的2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚和苯甲醛等均屬于大曲中的重要風味物質(zhì)[15-16]，吡嗪類物質(zhì)、愈創(chuàng)木酚、苯甲醛的形成與淀粉水解及蛋白質(zhì)水解作用相關[17]。菌株X20的高液化力特性有助于淀粉水解和糖化，糖和氨基酸等物質(zhì)經(jīng)過一系列復雜的生物化學變化，產(chǎn)生大曲中重要的風味物質(zhì)。因此，可初步確定菌株X20為大曲的功能菌株。

注：7為2, 5-二甲基吡嗪；11為 2,3,5-三甲基吡嗪；15為 2,3,5,6-四甲基吡嗪；18為苯甲醛；22為2,3-丁二醇；30為萘；31為愈創(chuàng)木酚；33為 4-乙基愈創(chuàng)木酚；34為對乙烯基愈創(chuàng)木酚。

Note: 7, 2,5-dimethylpyrazine;11, 2,3,5-trimethylpyrazine; 15, 2,3,5,6-tetramethylpyrazine; 18, benzaldehyde; 22, 2,3-butanediol; 30, naphthalene; 31, guaiacol; 33, 4-ethylguaiacol; 34, vinyl guaiacol.

圖2 菌株X20揮發(fā)性化合物的總離子流

Fig.2 Total ion chromatograms for the volatile compounds in X20 strain

2.4 菌株X20的菌落形態(tài)及其16S rDNA的鑒定

2.4.1 菌株X20的菌落形態(tài) 從圖3可見，菌株X20在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后形成乳白色、不規(guī)則圓形、不透明、濕潤并有光澤的菌落，菌落邊緣較中間厚，不產(chǎn)色素。同時，菌株X20經(jīng)革蘭氏染色顯陽性，在顯微鏡下觀察，細胞呈桿狀。

注： a,菌株X20的菌落形態(tài);b,菌株X20的細胞革蘭氏染色。

Note: a,colony morphology of X20;b,cell gram stain of X20.

圖3 菌株X20的細胞形態(tài)及其菌落形態(tài)特征

Fig.3 Gram dyeing and colony morphology of X20

注：M為0.1～2 Kb分子質(zhì)量Marker；1為16S rDNA PCR片段。

Note: M, 0.1～2 Kb molecular mass Marker; 1, 16S rDNA PCR fragment.

圖4 菌株X20的16S rDNA擴增

Fig.4 PCR amplification results of X20

2.4.2 菌株X20的分子生物學鑒定 從圖4可見，菌株X20的PCR擴增產(chǎn)物大小約為1.5 Kb，與預期值相吻合。將菌株X20的16S rDNA序列通過BLAST同源性分析發(fā)現(xiàn)，97%的比對序列都為芽孢桿菌屬的菌株，同源性最高的序列中有11個為枯草芽孢桿菌，序列同源性達99%。由圖5可知，從NCBI上選取最具代表性的18株菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000次重復獲得自展檢驗Bootstrap值， 菌株X20與枯草芽孢桿菌落在同一分支上，置信度為89%。因此，可初步判斷菌株X20為枯草芽孢桿菌。

圖5 菌株X20的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.5 Phylogenetic tree of strain X20

3 結(jié)論與討論

從濃香型大曲中分離出一株高液化力細菌X20，其液化力達11.756 g/(g· h)。經(jīng)16S rDNA鑒定結(jié)果顯示，該菌株與枯草芽孢桿菌同源性最高，達99%，可初步鑒定為枯草芽孢桿菌。HS-SPME-GC-MS結(jié)果顯示，菌株X20發(fā)酵產(chǎn)物中富含大曲中的重要風味成分，如吡嗪類物質(zhì)、愈創(chuàng)木酚、苯甲醛等。菌株X20不僅具有高液化力并且其發(fā)酵產(chǎn)物中富含大曲中的重要風味成分，可初步確定為大曲的功能菌株。

由于傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)大曲的生產(chǎn)受到地理、氣候、水質(zhì)等環(huán)境條件以及在此環(huán)境中滋生和孕育的其他微生物的影響，從而阻礙了制曲生產(chǎn)異地化發(fā)展。本研究從名優(yōu)白酒企業(yè)的菌種資源中篩選高液化力功能菌株，進一步改良大曲發(fā)酵功能菌群，為制曲生產(chǎn)異地化再現(xiàn)奠定了基礎。由于時間關系，僅對其主要功能特性及其代謝產(chǎn)物進行初步探究，關于菌株功能特性和大曲風味成分之間的聯(lián)系還有待進一步研究。

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(責任編輯： 王 海)

Isolation and Identification of a Bacteria from Luzhou-flavor Daqu

CHEN Xiaoxu1, MING Hongmei1*, LUO Huibo1, XU Defu2,ZHU Lili1, YAO Xia1, XUE Dengwen2

(1.EngineeringofBioengineeringInstitute,SichuanUniversityofScience,Zigong,Sichuan643000; 2.LuzhoulaojiaoCompanyLimited,Luzhou,Sichuan646000,China)

In order to filter out high stress liquefaction bacteria and provide references for Daqu functional bacteria flora construction, the authors usedplate screening test, solid state fermentation experiment, 16S rDNA and HS-SPME-GC-MS to seek the relationship between mieroorganism in Daqu and flower compounds. Results: The bacterial strain X20 had the highest liquefaction ability, up to 11.756 g/(g· h),the 16S rDNA sequence about X20 andBacillussubtilishomology as high as 99%, which could be identified asB.subtilis, the metabolites contained pyrazines, guaiacol, benzaldehyde and some other kinds of daqu important flavor. It could be initially identified as functional strain of Daqu.

Luzhou-flavor Daqu; high liquefaction ability; bacteria; functional strain; HS-SPME-GC-MS;16S rDNA

2015-03-24； 2015-07-01修回

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目“濃香型大曲優(yōu)勢菌的篩選及微生態(tài)制劑的研發(fā)”(NJ2011-13)；瀘州老窖科研獎學金項目“濃香型大曲中產(chǎn)香微生物的篩選及應用研究”(13ljzk04)；四川省教育廳重點科研項目“濃香型大曲微生態(tài)特征及立體制曲工藝優(yōu)化的研究”(15ZA0219)；四川省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目“濃香型大曲中產(chǎn)香菌的篩選及香曲制備研究”(201410622004)

陳曉旭(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：發(fā)酵工程。E-mail: 623086967@qq.com

*通訊作者：明紅梅(1971-)，女，副教授，碩士生導師，從事釀酒生物技術及應用研究。E-mail:839403036@qq.com

1001-3601(2015)07-0374-0110-04

S182； Q93-3; TS261.1

A