野外保存對(duì)益智葉片基因組DNA的影響

高炳淼， 王 朝， 何 萍， 田建平， 張俊清， 魏 娜

(海南醫(yī)學(xué)院 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?71199)

?

野外保存對(duì)益智葉片基因組DNA的影響

高炳淼， 王 朝， 何 萍， 田建平， 張俊清， 魏 娜*

(海南醫(yī)學(xué)院 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?71199)

為獲得高質(zhì)量的益智基因組DNA尋找一種簡(jiǎn)單可行的野外益智鮮葉保存方法,利用植物基因組提取試劑盒法提取益智基因組DNA，以新鮮葉片為對(duì)照及DNA的純度、濃度、瓊脂糖凝膠電泳和ITS-PCR擴(kuò)增效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較室溫陰干、室外曬干、硅膠干燥和液氮保存4種鮮葉保存方法對(duì)提取益智基因組DNA效果的影響。結(jié)果表明：4種保存方法均可獲得益智基因組DNA且ITS-PCR均獲得約700 bp的PCR產(chǎn)物，其中液氮保存5 d的葉片提取DNA條帶清晰明亮，室溫陰干、硅膠干燥和室外曬干保存方法提取的基因組DNA分別在4 d、3 d和2 d后開始發(fā)生降解，不同保存方法效果依次是液氮保存>室溫陰干>硅膠保存>室外曬干。在遠(yuǎn)距離野外資源調(diào)查和收集時(shí)，采用室溫陰干保存新鮮益智葉片是經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單可行的野外保存方法。

益智； DNA提?。?PCR； 野外保存方法

益智(AlpiniaoxyphyllaMiquel)為姜科山姜屬植物，其干燥成熟果實(shí)為常用中藥。益智仁為海南道地藥材之一，也是我國(guó)四大南藥之一，具暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾之功效[1]。益智原產(chǎn)熱帶[2]，主要為人工栽培，分布于海南、廣東雷州半島，此外廣西、福建、云南等地亦有栽培。其中，海南益智仁產(chǎn)量占總產(chǎn)量的95%以上[3]。近年來，對(duì)野生益智資源濫采亂挖現(xiàn)象嚴(yán)重，致使益智野生資源日漸枯竭，已成為瀕危藥用植物[4]。因此，益智野生資源的可持續(xù)性利用和保護(hù)勢(shì)在必行。

當(dāng)前，基于基因多態(tài)性的DNA分子標(biāo)記技術(shù)已在瀕危藥用植物野生資源利用與保護(hù)方面得到廣泛應(yīng)用，并成為科研工作者的研究熱點(diǎn)[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道利用不同方法保存麻黃、扁桃和楊樹等一些植物材料，但不同植物種類其保存方法存在差異[6-8]。筆者按照Chase[9]采用硅膠法保存野外采集的益智新鮮葉片，提取益智基因組DNA結(jié)果并不理想。但關(guān)于益智新鮮葉片的不同保存方法對(duì)南藥益智基因組DNA提取的影響尚未見報(bào)道。因此，尋找一種野外可行的保存益智葉片而不影響DNA質(zhì)量的方法，是目前本研究首要解決的問題。筆者通過對(duì)室溫陰干、室外曬干、硅膠和液氮保存4種野外可行的鮮葉保存方法保存的益智葉片樣品進(jìn)行基因組DNA提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法對(duì)其完整性、純度以及濃度進(jìn)行鑒定，再對(duì)其ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，旨在確定新鮮益智葉片的最佳保存方法，為提取出高質(zhì)量的基因組DNA奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)提供可靠保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 以益智的新鮮葉片為材料，采自野外移栽于海南醫(yī)學(xué)院校園的益智新鮮葉片。標(biāo)本憑證由海南醫(yī)學(xué)院田建平副教授鑒定為姜科植物益智。

1.1.2 試劑 PCR TaqMix、DL2000、RNaseA、植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)為天根產(chǎn)品均購(gòu)于海南雋譽(yù)科技有限公司，β-巰基乙醇、西班牙瓊脂糖(Biowest Agarose)均購(gòu)于海南合輝實(shí)業(yè)有限公司，Goldview核酸染料購(gòu)于賽百盛公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL16M)、恒溫水浴鍋(HH-S24)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 4100)、核酸蛋白分析儀(Eppendorf)、電泳儀(DYY-7)、PCR儀(杭州博日TC-96)、渦旋混合儀(WH-3)。

1.2 植物樣品保存

取益智嫩葉分別于室溫陰干、硅膠保存、室外曬干、液氮保存共4種方法保存。其中，15份樣品室溫陰干和硅膠保存時(shí)間為5 d，9份樣品室外曬干保存時(shí)間為3 d(樣品2 d已完全干燥，故只保存3 d即可)，3份液氮保存時(shí)間為5 d，每次取3份樣品保存于-80℃，鮮葉為對(duì)照。

1.3 基因組DNA提取

稱取200 mg益智新鮮或不同方法保存的葉片，置滅菌后的研缽中，加液氮迅速研磨后小心移入2 mL離心管中，按照天根植物基因組DNA試劑盒說明書提取。

1.4 DNA的電泳及紫外檢測(cè)

取5 μL基因組DNA樣品與1 μL上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣于含Goldview核酸染料的0.8%瓊脂糖凝膠孔中，電泳緩解液為1×TBE溶液，電壓為90 V條件下電泳30 min左右，用凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。

取20 μL DNA樣品用無菌ddH2O稀釋50倍，混勻后加入石英比色皿中，用核酸蛋白分析儀測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和280 nm的光吸收值。根據(jù)A260/A280的值判斷總DNA純度，并計(jì)算質(zhì)量濃度。DNA質(zhì)量濃度(μg/mL)=A260×稀釋倍數(shù)×50。

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以益智基因組中的核糖體DNA(nrDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列為模板，擴(kuò)增引物采用通用引物ITS1和ITS4，分別為5′-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3′和5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。具體ITS-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存方法的基因組DNA純度及濃度

由表可知，鮮葉和液氮保存提取的基因組DNA的A260/A280值分別為1.80和1.87，說明基因組DNA中的蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)較少，基因組DNA較純凈，基本無蛋白質(zhì)、多糖或RNA的污染。液氮保存后提取的基因組DNA與鮮葉提取獲得率基本相當(dāng)。室外曬干和硅膠保存樣品提取基因組DNA的A260/A280值均小于1.7，且隨保存時(shí)間延長(zhǎng)其A260/A280值和提取濃度不斷降低，說明硅膠保存和室外曬干保存的樣品提取的基因組DNA中蛋白或酚類雜質(zhì)污染不易除去。室溫陰干的葉片4 d內(nèi)提取基因組DNA的A260/A280值為1.8～2.0，存在少量雜質(zhì)如RNA未除凈，說明在4 d內(nèi)室溫陰干保存新鮮益智葉片效果較好。

表 不同保存方法益智基因組DNA的純度與得率

2.2 不同保存方法的瓊脂糖電泳比較

由圖1瓊脂糖電泳可知，不同保存方法的南藥益智葉片樣品的基因組DNA提取效果存在明顯差異。

1) 新鮮益智葉片提取的益智基因組DNA條帶整齊、明亮且無拖尾現(xiàn)象，說明新鮮樣品是提取基因組DNA的最理想材料(圖1A)。

2) 新鮮益智葉片硅膠保存5 d后的樣品提取基因組DNA如圖1B顯示，在保存的2 d前提取基因組DNA條帶整齊，主條帶下略有彌散帶；當(dāng)保存至第3天后，提取基因組DNA條帶彌散程度隨保存時(shí)間越來越嚴(yán)重，提取的量少且質(zhì)量不佳，表明基因組DNA已部分發(fā)生降解。表明，硅膠保存超過3 d后新鮮益智葉片基因組DNA降解，影響提取質(zhì)量。

3) 新鮮益智葉片放置于室溫陰干保存5 d后的樣品提取基因組DNA如圖1C顯示，在陰干保存3 d前提取基因組DNA樣品的條帶清晰、明亮整齊略帶拖尾現(xiàn)象；保存第4天后提取基因組DNA條帶明亮度明顯下降，僅提取量較少，但基因組仍然比較完整。表明，室溫陰干保存3 d內(nèi)可獲得產(chǎn)率較好的完整基因組DNA，5 d內(nèi)仍然可獲得完整的基因組DNA。

4) 新鮮益智葉片直接放于陽光充足的地方室外曬干保存，當(dāng)曬到第3天已完全干燥。曬干樣品提取基因組DNA如圖1D顯示，曬干第1天提取的基因組DNA樣品條帶清晰、整齊無拖尾現(xiàn)象，但獲得率較低；曬干第2天后，提取的基因組DNA樣品條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說明基因組DNA開始發(fā)生降解。表明，室外曬干2 d后基因組DNA開始發(fā)生降解，得率較少。

5) 新鮮益智葉片迅速置于液氮保存5 d后樣品提取基因組DNA如圖1E顯示，基因組DNA降解較少，提取效果好。保存時(shí)間不會(huì)影響其基因組DNA的提取效果。表明，液氮保存新鮮益智葉片能提取出高質(zhì)量的基因組DNA且無降解。

2.3 ITS-PCR分析不同保存方法提取的基因組DNA

植物的ITS具有保守性強(qiáng)，總長(zhǎng)度只有600～700 bp，采用通用ITS引物擴(kuò)增的PCR條帶應(yīng)在700 bp左右。不同保存方法提取的基因組DNA進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增的條帶大小與預(yù)期大小相符合(圖2)。從4種方法保存的益智葉片中提取的DNA均可擴(kuò)增出條帶，其中新鮮葉片、液氮和室溫陰干保存的擴(kuò)增條帶清晰、明亮而無彌散現(xiàn)象。硅膠保存第4天和室外曬干第2天樣品提取的基因組DNA擴(kuò)增條帶亮度相對(duì)較弱。表明，液氮和室溫陰干保存優(yōu)于硅膠和室溫曬干2種保存方法，硅膠保存和室外曬干保存不宜作為長(zhǎng)距離野外保存新鮮樣品的方法。

注： A 新鮮葉片：Lane M為D 2 000 DNA marker，泳道1～10為新鮮益智葉片。B 硅膠保存：泳道1～2為硅膠保存益智葉片1 d，泳道3～4為硅膠保存益智葉片2 d，泳道5～6為硅膠保存益智葉片3 d，泳道7～8為硅膠保存益智葉片4 d，泳道9～10為硅膠保存益智葉片5 d。C 室溫陰干：泳道1～2為室溫陰干保存益智葉片1 d，泳道3～4為室溫陰干保存益智葉片2 d，泳道5～6為室溫陰干保存益智葉片3 d，泳道7～8為室溫陰干保存益智葉片4 d，泳道9～10為室溫陰干保存益智葉片5 d。D 室外曬干：泳道1～2為曬干保存益智葉片1 d，泳道3～4為室外曬干保存益智葉片2 d，泳道5～6為室外曬干保存益智葉片3 d。E 液氮保存：泳道1～6為保存益智葉片5 d。

Note:A, fresh leaves: Lane M，D2 000 DNA marker; lane 1～10，fresh leaves. B, silica gel: lane 1～2， leaves with silica gel 1 d; lane 3～4， leaves with silica gel 2 d; lane 5～6，leaves with silica gel 3 d; lane 7～8，leaves with silica gel 4 d; lane 9～10，leaves with silica gel 5 d. C, room temperature: lane 1～2，leaves with room temperature 1 d; lane 3～4，leaves with room temperature 2 d; lane 5～6，leaves with with room temperature 3 d; lane 7～8，leaves with room temperature 4 d; lane 9～10，leaves with room temperature 5 d. D, outdoor season: lane 1～2，leaves with outdoor season 1 d; lane 3～4，leaves with outdoor season 2 d; lane 5～6，leaves with outdoor season 3 d. E, liquid nitrogen: lane 1～6，leaves with liquid nitrogen 5 d.

圖1 不同保存方法葉片提取的基因組DNA電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA from leaves saved by different preservation methods

注：M為D2000 DNA marker，泳道1為陰性對(duì)照，泳道2為新鮮葉片DNA為模板，泳道 3為液氮保存葉片DNA為模板，泳道4～8為硅膠保存葉片DNA為模板，泳道9～13為室溫陰干葉片DNA為模板，泳道14～16為室溫曬干葉片DNA為模板。

Note: lane M，D2000 DNA marker; Lane 1，negative control；lane 2， DNA of the fresh leaves as a template；lane 3，DNA of leaves stored in liquid nitrogen as a template；lane 4～8，DNA of leaves saved in silica as a template；lane 9～13，DNA of leaves dried in room temperature as a template；lane 14～16，DNA of leaves dried at outdoor season as a template.

圖2 ITS-PCR擴(kuò)增不同保存方法提取的DNA電泳圖譜

Fig.2 Electrophoresis of the ITS-PCR product for different preservation methods

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，4種保存方法均可獲得益智基因組DNA且ITS-PCR均獲得約700 bp的PCR產(chǎn)物，其中液氮保存5 d的葉片提取DNA條帶清晰明亮，室溫陰干、硅膠干燥和室外曬干保存方法提取的基因組DNA分別在4 d、3 d和2 d后開始發(fā)生降解，不同保存方法效果依次是液氮保存>室溫陰干>硅膠保存>室外曬干。

藥用植物基因組DNA提取是中藥分子生物學(xué)研究的基本手段，是中藥材分子標(biāo)記、中藥活性成分關(guān)鍵酶基因克隆等后續(xù)操作的基礎(chǔ)。提取藥用植物材料基因組的最佳材料是新鮮植物葉片，而干燥后中藥材的基因組DNA已發(fā)生嚴(yán)重降解，要求質(zhì)量較高的分子生物學(xué)研究無法滿足后續(xù)的試驗(yàn)。植物基因組中DNA的提取方法有多種，如CTAB法[11]、SDS法[12]、高鹽低pH法[13]等。不同提取方法對(duì)不同植物提取基因組DNA各有優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前植物基因組提取試劑盒法已廣泛應(yīng)用，且提取質(zhì)量和穩(wěn)定性好[14]。為保證提取方法不影響不同保存方法的樣品DNA，本試驗(yàn)采用植物基因組DNA試劑盒法提取益智葉片基因組DNA。

多數(shù)藥用植物，特別是野生及頻危的藥用植物都分布在偏遠(yuǎn)的山區(qū)，采集這些樣品后若保存方法不當(dāng)，新鮮材料在旅途中可能枯萎、腐爛，特別是一些離體材料極易受DNA酶的作用，從而導(dǎo)致DNA降解，而無法獲得高質(zhì)量的DNA[15]。通常情況下，植物材料在低溫環(huán)境下可長(zhǎng)期存放，如液氮保存下可以抑制相關(guān)酶的活性，使DNA降解速度減慢。因此，常采用液氮保存新鮮植物樣品材料，以保持其材料的新鮮度。本研究液氮保存后益智基因組DNA提取結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相類似，液氮是保存新鮮葉片的理想方法[7]。但在較遠(yuǎn)山區(qū)或者時(shí)間較長(zhǎng)的采樣時(shí)，若攜帶液氮凍存植物材料存在液氮易揮發(fā)、體積大和成本高等導(dǎo)致諸多不便。已有研究表明，用硅膠干燥和室溫陰干的葉子可以用于基因組DNA的提取[6-8]。從益智新鮮葉片中提取基因組DNA技術(shù)已比較成熟，但對(duì)于姜科植物益智從硅膠和室溫陰干等保存葉片中提取DNA還未曾有報(bào)道。本研究對(duì)比了硅膠保存、室外曬干和室溫陰干3種野外可行的保存野外新鮮益智葉片，結(jié)果表明室溫陰干效果優(yōu)于其他2種，與文獻(xiàn)報(bào)道的硅膠保存能有效保存基因組DNA的結(jié)果不同[9]。原因可能是由于植物材料的不同，南藥益智為多年生草本植物，其地上莖葉纖維質(zhì)含量高，可以有效地防止組織或細(xì)胞失水，延長(zhǎng)了其脫離母體后的保鮮時(shí)間，減緩了DNA的降解速度。室溫陰干的新鮮葉片置于開放的空氣中，而保存于硅膠密封袋內(nèi)反而使細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，加速了細(xì)胞凋亡導(dǎo)致基因組DNA更易發(fā)生降解[16]。

[1] 黃泰康.現(xiàn)代本草綱目(下卷)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001:2279-2281.

[2] 楊福孫,李榕濤,甘炳春,等.野生撫育益智光合特性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(2):123-126.

[3] 張俊清，段金廒，葉 亮，等.益智的歷史沿革與應(yīng)用特點(diǎn)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，21(17):289-292.

[4] 楊福孫,甘炳春,李榕濤,等.野生撫育益智主要性狀與產(chǎn)量的回歸模型及相關(guān)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(2):272-276.

[4] He H M, Xu Q Q, Chen R H. Relationship between the nutritive components of Alpinia oxyphylla and the environmental factors[J].Nat. Sci. J.Hainan Univ.,1992,10:38-44.

[5] 毛 帥,劉朝奇,向婷婷,等.基于DNA水平的中國(guó)藥用植物分子鑒定方法[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(5):238-242.

[6] 馬 帥,張 玲,焦培培,等.不同保存方法和提取方法對(duì)扁桃基因組DNA質(zhì)量的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2014,33(1):153-158.

[7] 朱田田,杜 弢,晉 玲,等.不同保存方法對(duì)中麻黃基因組DNA提取效果的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(1):23-25.

[8] 劉春英,樊軍鋒,高建社,等.葉片不同保存方法對(duì)楊樹基因組DNA提取效果的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2013,28(4):71-73.

[9] Chase H W, Hills H H. Silical gel: an ideal material for field preservation of leaf samples for DNA studies[J].Taxon,1991,40:215-220.

[10] 陳 業(yè),張玉晶,李婭迪,等.兜蘭ITS-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(7):51-55.

[11] 劉曉靜,王海燕,張根良,等.改良CTAB法提取益智基因組DNA[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,19(8):111-112.

[12] 王 玉,賈錦山,張娜娜,等.提取玫瑰基因組DNA幾種方法的比較[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2014,4(9):59-64.

[13] 裝 黎,牛慧媛,涂 政,等.改良高鹽低方法提取陳舊大麻初探[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(3):145-147.

[14] 李 會(huì),任志瑩,王 穎,等.不同DNA提取試劑盒提取作物種子基因組DNA效果的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(8):1956-1958.

[15] 張海燕,焦培培,李志軍,等.不同保存方法對(duì)胡楊、灰葉胡楊葉片總DNA質(zhì)量的影響[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào),2008,20(2):47-52.

[16] 胡翔宇,丁 瓊,宋希強(qiáng),等.2種保存方法對(duì)五唇蘭基因組DNA提取質(zhì)量的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2014,35(8):1546-1550.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Effects of Wild Preserved Methods on Genomic DNA fromAlpiniaoxyphyllaLeaves

GAO Bingmiao, WANG Chao, HE Ping, TIAN Jianping, ZHANG Junqing, WEI Na*

(HainanMedicalUniversity,HainanProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofTropicalMedicinalPlants,Haikou,Hainan571199,China)

In order to find a simple and practical method to save the wildA.oxyphyllafresh leaves, so as to obtain high quality genomic DNA,A.oxyphyllagenomic DNA was extracted using the plant genome Extraction Kit.Compared with fresh leaves, four different preserved methods (dried at room temperature, outdoor season, dried with silica gel, stored in liquid nitrogen) forA.oxyphyllaleaves were evaluated. The effects of which were compared based on the yield, purity, agarose gel electrophoresis and ITS-PCR amplification effect, to identify genomic DNA of leaves which were saved after different methods. Results:Four kinds of preservation methods can getA.oxyphyllagenomic DNA and ITS-PCR were obtained approximately 700 bp PCR product. Genomic DNA was extracted from leaves stored in liquid nitrogen five days, of which bands showed clear and bright, Genomic DNA was extracted from leaves stored in dried at room temperature, silica gel drying and outdoor season, which respectively start degraded after 4 d, 3 d and 2 d. The effect of different preservation methods are stored in liquid nitrogen > dried at room temperature > dried with silica gel > outdoor season.Therefore, freshA.oxyphyllaleaves stored at room temperature drying is both economical and feasible method of field preservation in the distant field resources investigation.

Alpiniaoxyphylla; DNA extraction; PCR； wild preserved methods

2014-01-29； 2015-05-11修回

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“益智遺傳多樣性的AFLP分析”(814291)；海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新課題“益智AFLP-PCR體系的建立與優(yōu)化”(Hyydc2013004)；海南醫(yī)學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)

高炳淼(1982-)，男，講師，博士，從事南藥資源開發(fā)與生物技術(shù)工作。E-mail:gaobingmiao@qq.com

*通訊作者：魏 娜(1980-)，女，副教授，從事南藥黎藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)工作。E-mail:weina-0613@163.com

1001-3601(2015)07-0351-0019-04

S567.7+9

A