日本晚櫻PrseSHP基因的克隆與功能分析

劉志雄，李來(lái)運(yùn)，李鳳蘭

（1長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025；2北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

日本晚櫻PrseSHP基因的克隆與功能分析

劉志雄1，2，李來(lái)運(yùn)1，李鳳蘭2

（1長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025；2北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

采用同源克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)，從日本晚櫻（Prunus lannesiana）品種‘大島櫻’中克隆到花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的PrseSHP基因（GenBank登錄號(hào)為GU362645）。PrseSHP基因序列全長(zhǎng)1 223bp，包含1個(gè)長(zhǎng)741bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼246個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。分子系統(tǒng)發(fā)生分析表明，PrseSHP屬M(fèi)ADS－box轉(zhuǎn)錄因子的PLE／SHP進(jìn)化系，并與薔薇科植物的SHP同源蛋白聚于同一進(jìn)化分支；蛋白序列比對(duì)顯示，該轉(zhuǎn)錄因子擁有M、I、K和C共4個(gè)結(jié)構(gòu)域，且其C末端結(jié)構(gòu)域中包含高度保守的AGⅠ和Ⅱ基序?；虮磉_(dá)分析表明，PrseSHP基因主要在‘大島櫻’的花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果等器官中表達(dá)，在花萼中僅能檢測(cè)到微弱的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，在幼葉中不表達(dá)，與其他植物SHP同源基因的表達(dá)模式有一定的差別。功能分析顯示，轉(zhuǎn)PrseSHP基因擬南芥植株明顯比野生型擬南芥弱小，轉(zhuǎn)基因擬南芥在6～8片蓮座葉后即抽薹開(kāi)花，時(shí)間較野生型擬南芥（14～17片蓮座葉后抽薹開(kāi)花）明顯提前，證明異位表達(dá)的PrseSHP基因能促進(jìn)擬南芥早花，其在花發(fā)育過(guò)程中可能參與調(diào)控植物開(kāi)花。

日本晚櫻；花發(fā)育；MADS－box；PrseSHP

日本晚櫻（Prunus lannesiana）是薔薇科（Rosaceae）著名的觀賞花木。其花色艷麗，冠型優(yōu)美，品種多，適應(yīng)性廣，觀賞價(jià)值高，被廣泛用于城市園林景觀建設(shè)［1］。隨著近年國(guó)內(nèi)賞櫻熱持續(xù)升溫，選育或引進(jìn)名優(yōu)櫻花品種，增加城市園林多樣性，滿(mǎn)足人們對(duì)人居環(huán)境日益增長(zhǎng)的審美需求顯得尤為重要。中國(guó)櫻花種質(zhì)資源豐富，開(kāi)展櫻花生殖發(fā)育調(diào)控研究，對(duì)櫻花雜交育種、遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新等均有較重要的意義。在擬南芥中，SHATTERPPOOF（SHP）是參與調(diào)控雌蕊、子房、胚珠和果實(shí)發(fā)育的C類(lèi)MADS－box基因，并具有促進(jìn)角果正常開(kāi)裂的功能［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，SHP基因還參與調(diào)控植物的胎座發(fā)育［3］。FBP6是矮牽牛（Petunia hybrida）SHP同源基因，其除參與調(diào)控心皮發(fā)育和果實(shí)開(kāi)裂外，還具有調(diào)控雄蕊正常發(fā)育和決定花分生組織特征的功能［4］；本氏煙草（Nicotiana benthamiana）的SHP同源基因NbSHP與FBP6基因功能相似［5－6］。但在茄科植物番茄（Solanum lycopersicum）中，其SHP同源基因TAGL1僅參與調(diào)控果皮的發(fā)育與果實(shí)的成熟，并不參與花分生組織特性決定，也未在雌蕊中表達(dá)［6－7］。而豆科苜蓿屬（Medicago）植物中的SHP同源基因有參與種間莢果形態(tài)分化的功能［8］。薔薇科植物桃（Prunus persica）的SHP同源基因PperSHP在成熟果實(shí)中的表達(dá)量明顯升高，并且在中、內(nèi)果皮明顯分離的栽培品種中表達(dá)更強(qiáng)［9，10］；FaSHP為草莓（Fragaria× ananassa）的SHP同源基因，其表達(dá)量的減少能延緩果實(shí)的成熟［11］。上述研究表明，不同類(lèi)群被子植物中的SHP同源基因，參與植物生殖發(fā)育調(diào)控的同時(shí)，其功能伴隨被子植物的演化而發(fā)生了分化。

相對(duì)模式植物和草本園藝作物而言，園林樹(shù)木童期長(zhǎng)，生殖發(fā)育過(guò)程復(fù)雜并季節(jié)性開(kāi)花，相關(guān)研究相對(duì)滯后。本研究以日本晚櫻里櫻系野生單瓣品種‘大島櫻’（P.lannesiana‘Makino’）為試材，系統(tǒng)研究其SHP同源基因在花和果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式和功能，為櫻花的分子輔助育種積累資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

2009年4～5月采集‘大島櫻’的幼葉、花芽和幼果，將雌雄蕊剛發(fā)育成熟但未開(kāi)放的花蕾按花萼、花瓣、雄蕊與雌蕊分開(kāi)，并將這4輪花器官、幼葉和幼果立即用液氮速凍，后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 日本晚櫻PrseSHP基因克隆 用EASYspin植物RNA提取試劑盒（北京艾德萊）提取‘大島櫻’花芽總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。參照文獻(xiàn)［1］的方法合成第一鏈cDNA和3′－RACE擴(kuò)增，3′－RACE基因特異引物為GSPSHP；根據(jù)獲得的3′－RACE擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)5′－RACE擴(kuò)增引物，利用5′－RACE試劑盒（Version 2.0，invitrogen公司），參照文獻(xiàn)［12］的方法，擴(kuò)增日本晚櫻PrseSHP基因的5′端序列，5′－RACE的第一鏈cDNA合成引物為GSP1SHP，第1次PCR和巢式PCR反應(yīng)的基因特異引物分別為GSP2SHP和GSP3SHP。根據(jù)5′－RACE和3′－RACE擴(kuò)增序列進(jìn)行電子拼接，在基因的5′－UTR和3′－UTR區(qū)設(shè)計(jì)克隆日本晚櫻PrseSHP基因全長(zhǎng)引物，驗(yàn)證拼接序列的真實(shí)性并分離出PrseSHP基因。PCR擴(kuò)增的上下游引物為PrseSHPF和PrseSHPR。PCR擴(kuò)增退火溫度為56～58℃、陽(yáng)性克隆鑒定參照文獻(xiàn)［12］。所用引物（表1）均由生工生物（上海）股份有限公司合成，DNA由華大基因測(cè)序。

1.2.2 蛋白同源比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)生分析 將PrseSHP基因編碼的蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中執(zhí)行Blast搜索與同源比對(duì)。并將PrseSHP轉(zhuǎn)錄因子同NCBI上SHP同源蛋白序列進(jìn)行比較。用MEGA5.0軟件，選鄰接法（Neighbour joining，NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)［13］。

1.2.3 半定量RT－PCR檢測(cè)PrseSHP基因表達(dá)的組織特異性 提取‘大島櫻’幼葉、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果中的總RNA，檢測(cè)其質(zhì)量與完整性，將其逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。用半定量RT－PCR技術(shù)檢測(cè)PrseSHP基因在這6種器官中表達(dá)的組織特異。并根據(jù)PrseSHP基因的特異序列設(shè)計(jì)上下游引物RTSHPF和RTSHPR，進(jìn)行RT－PCR分析之前，檢測(cè)引物的特異性；以日本晚櫻Actin基因作內(nèi)參，內(nèi)參引物序列和RT－PCR檢測(cè)參考文獻(xiàn)［14］。

1.2.4 載體構(gòu)建與功能分析 將PrseSHP基因包含完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的正義片段插入到XbaⅠ和SmaⅠ限制性酶切位點(diǎn)之間，并將其克隆到表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建載體的上下游引物為T(mén)PrseSHPF和TPrseSHPR。將構(gòu)建好的pBI121－PrseSHP表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101－90菌株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，用浸花法將35S：：PrseSHP轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Col－0［15］。收獲擬南芥T1代種子，消毒除菌后置于含50μg／mL卡拉霉素的1／2MS培養(yǎng)基上4℃暗培養(yǎng)24h，后轉(zhuǎn)入22℃，光暗周期16h／8h的溫室中培養(yǎng)10d，篩選根系發(fā)育良好，且真葉和生長(zhǎng)點(diǎn)都為綠色的植物為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗，經(jīng)煉苗、壯苗后移置到人工氣候箱，待開(kāi)花后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time RT－PCR，qRT－PCR）鑒定，檢測(cè)PrseSHP在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平。作qRT－PCR分析時(shí)，以擬南芥Actin基因?yàn)閮?nèi)參，非轉(zhuǎn)基因擬南芥為陰性對(duì)照，qRTPCR分析用的內(nèi)參基因上下游引物為qactinF和qactinR，PrseSHP基因的上下游引物為qPrseSHPF和qPrseSHPR，并觀察外源基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型，分析PrseSHP基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 PrseSHP基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

同源克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)，從‘大島櫻’花芽中分離出PrseSHP基因完整cDNA全長(zhǎng)。序列結(jié)構(gòu)分析表明，日本晚櫻PrseSHP基因序列cDNA全長(zhǎng)為1 223bp，包括264bp的5′－UTR、741bp的完整ORF和218bp的3′－UTR，編碼246個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。在NCBI網(wǎng)站上執(zhí)行Blast搜索和序列同源比對(duì)顯示，其與MADS－box基因家族中的SHP進(jìn)化系親緣關(guān)系最近，命名為PrseSHP，GenBank登錄號(hào)為GU362645。

2.2 蛋白序列同源比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)生分析

圖1表明：日本晚櫻PrseSHP與桃的PperSHP親緣關(guān)系最近，同蘋(píng)果的MdMADS14親緣關(guān)系次之，三者同其他薔薇科植物的SHP同源蛋白聚于同一進(jìn)化分支，與其他科屬植物的SHP同源蛋白分開(kāi)，聚類(lèi)結(jié)果支持傳統(tǒng)經(jīng)典分類(lèi)學(xué)種屬間的親緣關(guān)系。蛋白序列同源比對(duì)（圖3）顯示：PrseSHP轉(zhuǎn)錄因子包含1個(gè)高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域，由57個(gè)氨基酸殘基組成（16～72）；1個(gè)次級(jí)保守的K結(jié)構(gòu)域，含82個(gè)氨基酸（105～186），由K1（105～126）、K2（139～153）和K3（161～186）3個(gè)含疏水氨基酸殘基的亞結(jié)構(gòu)域［16］；其MADS區(qū)與K區(qū)之間，含1個(gè)保守性相對(duì)較低的間隔區(qū)I區(qū)，由32個(gè)氨基酸殘基組成（73～104）；該轉(zhuǎn)錄因子C末端結(jié)構(gòu)域序列變異較大，由60個(gè)氨基酸殘基組成（187～246），包含2個(gè)十分保守的AGⅠ和Ⅱ基序，屬C類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子；另外，該轉(zhuǎn)錄因子的N末端還有一段由15個(gè)氨基酸殘基組成的延伸序列。

2.3 花器官與幼果中PrseSHP基因表達(dá)的半定量RT－PCR檢測(cè)

半定量RT－PCR檢測(cè)（圖2）顯示：PrseSHP主要在‘大島櫻’的花和果中表達(dá)，在幼葉中不表達(dá)；其在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達(dá)量高，在花萼中表達(dá)量低。且PrseSHP基因在‘大島櫻’花瓣、雄蕊，雌蕊和幼果中的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05），但其在這些器官中的轉(zhuǎn)錄活性均顯著高于花萼（P＜0.05）。

2.4 PrseSHP基因的功能分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證PrseSHP基因在日本晚櫻生殖發(fā)育過(guò)程中的功能，將PrseSHP基因的正義片段克隆到雙元表達(dá)載體pBI121中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入野生擬南芥?？股睾Y選和qRT－PCR鑒定（圖4）結(jié)果共獲得23棵35S：：PrseSHP擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，跟蹤觀察這些轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型發(fā)現(xiàn)，23株轉(zhuǎn)基因擬南芥中有17株擬南芥開(kāi)花時(shí)間明顯提前，占轉(zhuǎn)基因植株總數(shù)的73.9%，其在6～8片蓮座葉后即抽薹開(kāi)花（圖5，B、C），而相同生長(zhǎng)條件種植的野生型擬南芥要長(zhǎng)到14～17片蓮座葉后才抽薹開(kāi)花（圖5，A）。并且，所有轉(zhuǎn)基因植株明顯比野生型擬南芥弱小，但其花器官結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變（圖5，B、C）。說(shuō)明PrseSHP基因在花發(fā)育過(guò)程中能促進(jìn)植物早花。

3 討 論

同源序列比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)生分析表明，‘大島櫻’PrseSHP屬C類(lèi)MADS－box轉(zhuǎn)錄因子的PLE／SHP進(jìn)化系，并與薔薇科植物SHP同源蛋白聚于同一進(jìn)化分支。表達(dá)分析表明，PrseSHP主要在‘大島櫻’的花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果等器官中表達(dá)，在花萼中僅能檢測(cè)到微弱的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，在幼葉中不表達(dá)，其表達(dá)模式與其他類(lèi)群植物中的SHP同源基因有一定的差異。

PperSHP為日本晚櫻近緣種桃的SHP同源基因，其僅在雄蕊、雌蕊和果實(shí)中表達(dá)，主要參與果實(shí)的發(fā)育［9］；而薔薇科另一植物太行花的SHP同源基因TrSHP僅在發(fā)育中的雄蕊和雌蕊中表達(dá)，隨著子房中胚珠的發(fā)育，其轉(zhuǎn)錄活性?xún)H局限在胚珠中，參與調(diào)控胚珠的發(fā)育［17］。TAGL1為茄科植物番茄的SHP同源基因，在花發(fā)育過(guò)程中其主要在雄蕊和雌蕊中表達(dá)，并且在花瓣中也能檢測(cè)到微弱的轉(zhuǎn)錄信號(hào)；但在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，其僅在果皮中表達(dá)，參與調(diào)控果皮的發(fā)育與果實(shí)的成熟［7］；FBP6是矮牽牛的SHP同源基因，其主要在雄蕊、柱頭和胚珠中表達(dá)，除參與調(diào)控雌蕊發(fā)育和果實(shí)開(kāi)裂外，還參與調(diào)控花分生組織的形成，促進(jìn)植物開(kāi)花［4］?？梢?jiàn)，不同類(lèi)群植物中SHP同源基因除表達(dá)模式變化外，其功能也發(fā)生了相應(yīng)的分化。從日本晚櫻PrseSHP基因的表達(dá)模式及35S：：PrseSHP轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型推測(cè)，PrseSHP在發(fā)育過(guò)程中具有促進(jìn)開(kāi)花和參與調(diào)控果實(shí)發(fā)育的功能，其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Function Identification of PrseSHPGene from Prunus lannesiana（Rosaceae）

LIU Zhixiong1，2，LI Laiyun1，LI Fenglan2
（1College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；2College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Full cDNA of one MADS－box gene，PrseSHPwith GenBank accession No.GU362645，was cloned from Prunus lannesiana using homologous cloning and RACE method.The full length of PrseSHPcDNA is 1 223bp，containing an open reading frame（ORF）of 741bp and coding for a polypeptide of 246amino acid residues.Sequence and phylogenetic analyses grouped PrseSHP into PLE／SHP lineages of the MADS－box family.Conceptual translation revealed that PrseSHP contain MADS，I，K and C domains.Expression analysis suggested that PrseSHPexpressed mainly in petal，stamen，gynoecium and young fruit of P.lannesiana‘Makino’.Moreover，functional analysis suggested that transgenic Arabidopsis was obviously dwarf，and flowering during 6－8rosette leaves，which was early than that of wild－type Arabidopsis who was flowering during 14－17rosette leaves.Ectopic expression of PrseSHPcould obviously promote flowering of transgenic Arabidopsis.Our results suggest that PrseSHPare involved in flowering in Cherry Blossom.

Prunus lannesiana；flower development；MADS－box；PrseSHP

Q786

A

1000－4025（2015）08－1506－05

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1506

2015－05－15；修改稿收到日期：2015－07－17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101202）；長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金（801190010118）。

劉志雄（1977－），男，博士，副教授，主要從事園林植物分子育種研究。E－mail：zxliu77＠yahoo.com