大黃酸聚乳酸納米粒的制備及體外評(píng)價(jià)*

★　 陳丹飛　王國偉　徐駿軍　尚小廣　朱永琴　(浙江中醫(yī)藥大學(xué)　杭州 310053)

大黃酸聚乳酸納米粒的制備及體外評(píng)價(jià)*

★ 陳丹飛*第一作者：陳丹飛 (1989—)，女，在讀碩士研究生。Tel:15158192215，E-mail: mschendanfei@163.com。王國偉徐駿軍尚小廣朱永琴(浙江中醫(yī)藥大學(xué)杭州 310053)

摘要：目的:制備包載大黃酸的聚乳酸納米粒(RH-PLA-NPs)，考察其理化性質(zhì)，并評(píng)價(jià)其體外特性。方法:優(yōu)選聚乳酸(PLA)為載體，采用自乳化溶劑擴(kuò)散法來制備RH-PLA-NPs。在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選RH-PLA-NPs制備處方并考察工藝穩(wěn)定性，透射電鏡觀察其外觀形態(tài)，激光粒度儀測(cè)定粒徑及Zeta電位，超速離心法結(jié)合HPLC測(cè)定包封率及載藥量，透析法考察其體外釋藥特性，MTT法評(píng)價(jià)其對(duì)Caco-2細(xì)胞的生物安全性。結(jié)果:最佳工藝制備的RH-PLA-NPs外觀呈圓整球形，平均粒徑為(134.37±3.61)nm，多分散系數(shù)為(0.099±0.023)，Zeta電位(-18.42±0.07)mV，包封率(60.38±1.51)%和載藥量(1.33±0.08)%；體外釋藥呈緩釋特性，在PBS緩沖液和含20%乙醇PBS緩沖液中24h累積釋放百分率分別為87.08%和93.05%，釋放行為均符合Weibull方程，分別為lnln(1/1-Q)=1.1317lnt-1.8613(R=0.9693)和lnln(1/1-Q)=1.0512lnt-1.6707(R=0.9873)；在0～200 μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)Caco-2細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性。結(jié)論:成功制備了RH-PLA-NPs，其粒徑分布均勻，包封率及載藥量較高，體外釋藥具有緩釋特征，并且具有良好的生物安全性，是一種有開發(fā)前景的新制劑。

關(guān)鍵詞：大黃酸；聚乳酸；納米粒；正交設(shè)計(jì)；體外評(píng)價(jià)

大黃酸(Rhein，RH)為蓼科植物掌葉大黃 (RheumpalmatumL．)的根莖提取物，屬于單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌及調(diào)節(jié)腎功能等作用[1]，但是RH水溶性差、半衰期短，生物利用度低，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用[2-3]。納米粒(Nanoparticles，NPs)作為一種新型藥物載體，具有提高難溶性藥物的水溶性、延長(zhǎng)藥物半衰期、緩控釋等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了乳劑、脂質(zhì)體等載體易泄漏藥物等缺點(diǎn)。近年來，隨著NPs研究的進(jìn)一步深入，其在改善難溶性藥物口服吸收，提高生物利用度等方面的應(yīng)用亦引起了極大的關(guān)注。

聚乳酸(Polylactic acid，PLA)具備優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，且價(jià)格低廉，相對(duì)分子量可控，現(xiàn)已經(jīng)被FDA和CFDA批準(zhǔn)用于制備NPs、微球、微囊等制劑的藥用輔料，是制備NPs的理想載體材料。本研究以PLA為載體材料，采用改良的自乳化溶劑擴(kuò)散法(Modified-spontaneous Emulsification Solvent Diffusion Method，M-SESD)制備RH-PLA-NPs，以包封率、載藥量和粒徑為主要指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝篩選處方，透析法考察其體外釋藥特性，MTT法評(píng)價(jià)其對(duì)Caco-2細(xì)胞的生物安全性，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。為RH及同類藥物的納米制劑開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1試劑和儀器

RH (陜西森弗生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)20090320)；RH對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110757200206)；泊洛沙姆188(德國BASF，批號(hào)WPWA-544C)；聚乳酸(山東岱罡生物科技有限公司，外消旋DL型，M=10000，批號(hào)09111917)；甲醇(美國Honeywell)；磷酸(美國TEDIA)；0.25%胰蛋白酶溶液，D-Hanks緩沖液(美國Gibco)；DMEM(含有4.5 g/L葡萄糖、3.7 g/L碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Caco-2細(xì)胞(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心凍存，原購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。

Agilent-l200高效液相色譜儀器(美國Agilent)；ZLS380激光粒度儀(美國Nicomp)；LabConco冷凍干燥機(jī)(美國Labconco)；超速離心機(jī)(美國Beckman)；TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭儀器公司)；HJ-6B磁力加熱攪拌機(jī)(金壇市金偉實(shí)驗(yàn)儀器公司)；CP225D型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)； S-212型恒速攪拌器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；Mill-Q超純水器(美國Millpore)；透析袋(截留分子量為3000上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1納米粒的制備

采用M-SESD制備RH-PLA-NPs，取一定量的RH和PLA溶于一定比例的丙酮與乙醇的混合溶劑中，構(gòu)成有機(jī)相；另取一定體積的poloxamer 188水溶液作為水相；將有機(jī)相以緩慢滴加到一定攪拌速度下的水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌30 min，減壓蒸出有機(jī)溶劑和部分水，得到帶有藍(lán)色乳光的RH-PLA-NPs膠體溶液，冷凍干燥后得RH-PLA-NPs凍干粉。

2.2測(cè)定方法的建立

2.2.1色譜條件色譜柱：Platisil ODS型(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶0.1%磷酸(75∶25)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2.2.2專屬性考察按“2.2.1”項(xiàng)下方法，制備不加入RH的空白PLA-NPs。RH對(duì)照品溶液、空白PLA-NPs和RH-PLA-NPs混懸液的色譜圖見圖1，可見雜質(zhì)峰與藥物峰分離較好，輔料和溶劑對(duì)藥物測(cè)定無干擾，色譜的專一性良好，RH的保留時(shí)間約為8.44 min。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密配成濃度為0.122 mg/mL的RH對(duì)照品貯備液。分別量取RH對(duì)照品貯備液0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 mL至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度為0.612，1.224，2.448，4.896，9.792，19.584，39.168μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。大黃酸在0.612～39.168 μg/mL范圍內(nèi)A和C呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：A=71.272C-12.817，r=0.9998(n=7)。

2.2.4精密度考察精密量取不同體積RH對(duì)照品儲(chǔ)備液于容量瓶中，用甲醇稀釋成0.612，4.896，39.168μg/mL三種濃度，分別在日內(nèi)測(cè)定5次并且連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算RH的日內(nèi)、日間精密度。日內(nèi)和日間精密度RSD分別為0.54%，0.47%，0.58%和1.05%，0.86%，0.72%，符合方法學(xué)要求。

2.2.5回收率考察按處方量的80%，100%，120%精密稱取RH對(duì)照品，分別加處方比例輔料，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成濃度分別為17.2，21.5，25.8μg/mL的溶液。經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液測(cè)定，平行操作6次，計(jì)算回收率分別為97.72±1.32%，101.01±0.94%，99.97±1.75%，表明回收率符合方法學(xué)要求。

A.RH 標(biāo)準(zhǔn)溶液; B. PLA-NPs; C.RH-PLA-NPs

2.2.6穩(wěn)定性考察取同一樣品溶液于室溫下放置，于0 ,2 ,4 ,8 ,12 ,24 h測(cè)定，考察室溫對(duì)RH穩(wěn)定性的影響，RSD為0.34%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前期單因素考察結(jié)果，選擇PLA處方量(A)、poloxamer 188濃度(B)、丙酮乙醇體積比(C)、有機(jī)相體積(D)為實(shí)驗(yàn)因素，各因素選取3個(gè)水平，見表1。按正交設(shè)計(jì)表L9(34)安排實(shí)驗(yàn)，以NPs粒徑、包封率為考察指標(biāo)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

應(yīng)用綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，粒徑(y1)和包封率(y2)分別按50%和50%的系數(shù)積分，綜合評(píng)分(y)=0.5(208.42-y1)+ 0.5[140.70-(100-y2)]，結(jié)果見表2和表3。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

由表2極差分析R值可知，在以粒徑和包封率為考察指標(biāo)的四個(gè)影響因素中，影響順序?yàn)椋篜LA處方量(A)>poloxamer 188濃度(B)>有機(jī)相體積(D)>丙酮乙醇體積比(C)。由表3分析可知，影響因素A、B、D對(duì)粒徑和包封率均具有顯著影響(P<0.05)，而C對(duì)其影響不顯著。為了制備粒徑小，包封率高的RH-PLA-NPs，選擇最佳組合為A1B1C2D2，即PLA為100 mg，poloxamer 188濃度為1.0 %，丙酮與乙醇體積比為3∶2，有機(jī)相體積為15 mL。

2.4最佳工藝驗(yàn)證

為進(jìn)一步考察最佳工藝的穩(wěn)定性，按照正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝，制備3批RH-PLA-NPs。由表4可知，NPs的平均粒徑、PDI、Zeta電位、包封率和載藥量均相對(duì)穩(wěn)定，表明制備工藝穩(wěn)定性較好。

表4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.5質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1外觀形態(tài)制備得到的RH-PLA-NPs混懸液呈淺黃色、澄清、乳光明顯。吸取適量RH-PLA-NPs混懸液滴于銅網(wǎng)上，靜置2 min后用濾紙吸干，滴加2.0%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染13 min后用濾紙吸干殘留液，自然揮干，用透射電鏡觀察，見圖2。NPs呈圓球顆粒，表面圓滑，大小均勻，分布良好，粒子之間未見粘連及團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖2　RH-PLA-NPs透射電鏡照片(×60000)

2.5.2平均粒徑和Zeta電位取適量RH-PLA-NPs混懸液，用激光粒度儀測(cè)定平均粒徑和Zeta電位，按軟件程序進(jìn)行測(cè)定，自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果NPs的平均粒徑為(134.37±3.61)nm，PDI為(0.099±0.023)，Zeta電位為(-18.42±0.07)mV。

2.5.3包封率和載藥量的測(cè)定精密量取RH-PLA-NPs混懸液1.0 mL，加入具塞離心管中，超速離心(室溫，18000 r/min，30min)后取上清液200 μL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液測(cè)定，計(jì)算上清液中的藥物含量，記作W1；另精密量取RH-PLA-NPs混懸液1.0 mL，加入適量甲醇后超聲，定容至15 mL，按同法求得NPs中總的藥物含量，記作W0；按公式計(jì)算NPs的包封率和載藥量，結(jié)果包封率為(60.38±1.51)%，載藥量為(1.33±0.08)%。

EE%=(W0-W1)/W0×100%

DL%=(W0-W1)/Wt×100%

W0：NPs中的總藥物量；W1：NPs中的游離藥物量；Wt：NPs的總重量。

2.6體外釋藥考察

選擇pH 7.4 PBS緩沖液和含20%乙醇的pH 7.4 PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)，采用透析法對(duì)RH原藥溶液(RH-Sol)與RH-PLA-NPs的體外釋放特性進(jìn)行研究。分別精密量取RH-Sol和RH-PLA-NPs混懸液適量，各6份，置于透析袋內(nèi)，用透析夾夾緊。將透析袋置于預(yù)先保溫的50 mL釋放介質(zhì)中，放于(37±0.5)℃恒溫水浴振蕩(75 r/min)中恒溫振蕩，分別于0.1,0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,2.5,3,4,5,6,8,12,24 h取釋放介質(zhì)試樣2 mL，立即補(bǔ)加等量同溫空白釋放介質(zhì)。用0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算累積釋放百分率(Q)。

RH-Sol與RH-PLA-NPs在PBS緩沖液和含20%乙醇的PBS緩沖液中的釋藥曲線見圖3。由圖可知，RH-Sol在兩種釋放介質(zhì)中釋藥均很快，4 h時(shí)藥物已基本全部釋放，累積釋放百分率分別為97.12%和96.33%，但RH-PLA-NPs釋藥行為主要分為突釋和緩釋兩相，開始時(shí)釋放較快，4h時(shí)藥物的累積釋放百分率分別為61.60%和61.25%，隨后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，緩慢釋藥，于24h時(shí)累積釋放百分率分別為87.08%和93.05%。

圖3　體外釋放曲線(n=6)

表6　體外釋放曲線擬合(含20%乙醇的PBS緩沖液)

分別用零級(jí)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型、Weibull模型對(duì)RH-PLA-NPs體外釋藥行為進(jìn)行擬合， RH-PLA-NPs在PBS緩沖液和含20%乙醇的PBS緩沖液中的釋藥行為均符合Weibull方程，分別為lnln[1/(1-Q)]=1.1317lnt-1.8613(R=0.9693)和lnln[1/(1-Q)]= 1.0512lnt-1.6707(R=0.9873)。

2.7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

Caco-2細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2，相對(duì)濕度90%)連續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d用含0.02% EDTA的胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為1×105個(gè)/mL，每孔加入190L培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。然后實(shí)驗(yàn)組分別加入不同溶度的PLA-NPs和RH-PLA-NPs的混懸液10L，最終濃度分別為0.01 ,0.1,1,5,20,50,100,200 μg/mL，空白對(duì)照組加入無菌生理鹽水，每組每濃度設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后，每孔滴加5 mg/mL的MTT溶液10 L，微量振蕩器上振蕩3～5 min，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，在微量振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處其光密度(OD)值。取6個(gè)孔平均OD值計(jì)算細(xì)胞的存活率(IC)，IC=(實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值) 100%。

采用MTT法測(cè)定了PLA-NPs和RH-PLA-NPs對(duì)Caco-2的細(xì)胞毒性。如圖4所示，孵育24 h后，在納米粒濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率仍然保持在90%以上。此外，在較高濃度時(shí)，RH-PLA-NPs的毒性略高于空白PLA-NPs，可能是由于包載在納米粒中的RH對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0～200 μg/mL范圍內(nèi)，PLA-NPs和RH-PLA-NPs納米載體對(duì)Caco-2細(xì)胞無明顯的毒性作用，具有良好的生物安全性。

圖4　PLA-NPs和RH-PLA-NPs對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性

3討論

對(duì)于水不溶性藥物，制備NPs應(yīng)用較多的是溶劑蒸發(fā)法、溶劑擴(kuò)散法和鹽析法等，但這些方法在實(shí)際應(yīng)用中受到很大的限制，如制備中需使用二氯甲烷、二甲基亞砜等有毒有機(jī)溶劑；需均質(zhì)器、超聲細(xì)胞破碎儀等高能設(shè)備。而自乳化溶劑擴(kuò)散法(SESD)能克服以上不足，特別適合于脂溶性藥物納米粒的制備，Murakam等[8]首次在SESD的基礎(chǔ)上改進(jìn)使用M-SESD，以丙酮與乙醇代替?zhèn)鹘y(tǒng)的丙酮和二氯甲烷，同時(shí)在水相中加入適量的表面活性劑，充分利用了丙酮和乙醇混合溶劑對(duì)聚合物、藥物和表面活性劑的不同溶解性，通過溶劑的自發(fā)擴(kuò)散制備NPs，大大提高藥物的包封率。

難溶性藥物既可完全包封于NPs的疏水性核中，也可被吸附于NPs的表面，還可存在于NPs的淺表層或殼層內(nèi)，故不同NPs部位的藥物釋放速度不同[5-6]。體外釋藥考察顯示，與RH-Sol相比，RH-PLA-NPs具有明顯的緩控釋效果。RH-Sol于4h時(shí)藥物已基本全部釋放，而RH-PLA-NPs于4h時(shí)藥物在PBS緩沖液和含20%乙醇的PBS緩沖液中的累積釋放百分率分別為61.60%和61.25%，隨后釋放曲線漸趨平穩(wěn)，于24h時(shí)累積釋放百分率分別為87.08%和93.05%。RH-PLA-NPs的釋藥行為呈現(xiàn)突釋和緩釋兩相，突釋現(xiàn)象可能是由于poloxamer 188具有很強(qiáng)的親水性，在釋放介質(zhì)可以從分布于NPs表面的細(xì)小孔洞滲入到內(nèi)部后，NPs表面和孔洞中的RH都被快速釋放，形成“突釋效應(yīng)”。而緩釋現(xiàn)象可能是由于PLA聚合物在緩慢解鏈溶解過程中，隨著往NPs核心部位的“溶蝕”，NPs內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸變得緊密而使釋放介質(zhì)滲入受阻，形成藥物的緩慢控釋。

本研究采用M-SESD法成功制備了包載大黃酸的聚乳酸納米粒，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選的處方具有較高的包封率和載藥量，并且粒徑分布均勻，穩(wěn)定性好，體外釋藥具有緩釋特性，并且具有良好的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)為RH納米制劑的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為同類藥物的研究提供參考。

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Preparation and in Vitro Evaluation of Rhein-loaded Polylactic Acid Nanoparticles

CHEN Dan-fei, WANG Guo-wei, XU Jun-jun, SHANG Xiao-guang, ZHU Yong-qin

ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053，China.

Abstract:Objective: To investigate the optimal preparation and prepare of RH-PLA-NPs，and to evaluate its in vitro property. Methods:Using PLA as carriers and applying modified spontaneous emulsification solvent diffusion to prepare RH-PLA-NPs, optimizing and screening the prescription by orthogonal design optimization, ultra-high speed centrifugal combination with methanol extraction to determinate the encapsulation efficiency and drug loadings rate, transmission electron microscope to observe appearance, laser particle size tester to determine the average particle size and Zeta potential , and using dialysis method to investigate in vitro release characteristics, MTT method to investigate the cytotoxicity on Caco-2 cells. Results:The results showed that RH-PLA-NPs were uniform size and round, and formed of (134.37±3.61) nm in particle size with PDI of (0.099±0.023), Zeta potential of (-18.42±0.07) mV, entrapment efficiency of (60.38±1.51)%, and drug loading of (1.33±0.08)%. The in vitro release profiles in PBS and PBS with 20% EtOH conform to the Weibull equation: lnln(1/1-Q)=1.1317lnt-1.8613(R=0.9693) and lnln(1/1-Q)= 1.0512lnt- 1.6707(R=0.9873), and 24 h release rate was 87.08% and 93.05%. Within the scope of the 0 200 μg/mL, RH-PLA-NPs had no obvious toxicity on Caco-2 cells. Conclusion:Preparing RH-PLA-NPs successfully with uniform particle size, higher drug-loading rate and encapsulation efficiency, control release characteristics and good biocompatibility. RH-PLA-NPs have promising prospects for further development.

Key words:Rhein; Polylactic Acid; Nanoparticles; Orthogonal Design; In Vitro Evaluation

收稿日期：(2014-12-25)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：TQ461

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：*浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(2013R410058)。