大黃素通過抑制p38 MAPK活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞COX-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

王慧娟 馮社軍 武艷強(qiáng) 李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

大黃素通過抑制p38 MAPK活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞COX-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

王慧娟 馮社軍 武艷強(qiáng) 李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 探討大黃素能否通過抑制p38 MAPK活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞COX-2表達(dá)。方法 將神經(jīng)元PC12細(xì)胞分為3組：對照組(Control組)、大黃素+H2O2組 (Emodin+H2O2組)和H2O2組。在300μM的H2O2干預(yù)4小時(shí)后使用RT-PCR法和western blot法對各組PC 12細(xì)胞COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測；并使用western blot法對PC12細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值)進(jìn)行測量。結(jié)果 與對照組相比較，在300μM的H2O2干預(yù)4小時(shí)后PC12細(xì)胞COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及p38 MAPK磷酸化水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但H2O2組較Emodin+H2O2組COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)的升高以及p38 MAPK磷酸化水平的增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 大黃素可以有效抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞COX-2表達(dá)，并與下調(diào)p38 MAPK活化水平密切相關(guān)。

大黃素； PC12細(xì)胞； 過氧化氫； 環(huán)氧化酶-2； p38 MAPK

神經(jīng)元保護(hù)即減輕神經(jīng)元損傷和挽救受損的神經(jīng)元是腦卒中(stroke)治療的關(guān)鍵和重點(diǎn)[1-4]。腦卒中時(shí)神經(jīng)組織血流灌注障礙組織缺血缺氧直接和間接導(dǎo)致的嚴(yán)重氧化應(yīng)激(oxidative stress)和炎癥反應(yīng)(inflammation)是造成神經(jīng)元損傷和死亡的重要原因[1-4]。研究證實(shí)減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可有效減少神經(jīng)元的死亡，并對腦卒中患者預(yù)后有重要價(jià)值[5-8]。大黃素(emodin)是中草藥大黃(rhubarb)最主要的藥理成分之一。目前研究發(fā)現(xiàn)大黃素對多種致炎因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用，并認(rèn)為該作用與抑制p38 MAPK的磷酸化密切相關(guān)[9, 10]。本研究的目的是探討大黃素能否通過抑制p38 MAPK活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞COX-2的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 大鼠嗜鉻瘤PC12細(xì)胞株從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買；大黃素(純度>98%)購買于西安崇信天然添加劑有限公司；總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；兔抗鼠COX-2抗體、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗體、兔抗鼠p38 MAPK和兔抗鼠β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，DMSO (二甲基亞砜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每72h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞分為對照組(Control組)、大黃素+H2O2組(Emodin+H2O2組)和H2O2組，共3組。其中對照組細(xì)胞加入PBS；H2O2組和大黃素+H2O2組加入H2O2(300μM)；大黃素+H2O2組加入50mM的大黃素進(jìn)行干預(yù)。

1.3 細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)檢測 干預(yù)4h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。引物：COX-2正義5′- TTCCAACCCATGTCAAAACCG-3′，反義5′-GTCAACACGTATCTCATGGAT-3′和β-actin正義：5′- ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反義：5′- GCCGCTGGGGAAGATGTGCT-3′。按照試劑盒說明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為COX-2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 Western blot法檢測細(xì)胞中COX-2、phospho-p38 MAPK和total p38 MAPK蛋白表達(dá) 按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠COX-2抗體 (1∶1000)、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗體(1∶900)、兔抗鼠p38 MAPK抗體(1∶900)和兔抗鼠β-actin 抗體(1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。使用COX-2/β-actin和Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK顯影強(qiáng)度比值進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá) 在干預(yù)4h后，對PC12細(xì)胞COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用RT-PCR法和western blot法進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，PC12細(xì)胞在H2O2刺激后COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。但H2O2組較大黃素+H2O2組COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)增加更加明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<005)，見圖1和表1。

圖1 PC12細(xì)胞COX-2表達(dá)的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 1 The RT-PCR and western blot results of COX-2 in PC12 cells

Table1 The mRNA and protein expression of COX-2, and the activation of p38 MAPK in PC12 cells

組別COX-2mRNACOX-2蛋白Phospho-p38MAPK/totalp38MAPKControl組0.24±0.050.19±0.040.16±0.05Emodin+H2O2組0.67±0.18①②0.71±0.13①②0.42±0.09①②H2O2組0.93±0.07①0.95±0.08①0.91±0.06①

注：①與Control組相比較P<0.05；②與H2O2組相比較P<0.05。

2.2 p38 MAPK的活化水平 在H2O2干預(yù)4h后，使用western blot法對PC12細(xì)胞p38 MAPK活化水平即p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK / total p38 MAPK比值)檢測。我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，PC12細(xì)胞在H2O2干預(yù)后phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但H2O2組較Emodin+ H2O2組phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表1。

圖2 PC12細(xì)胞p38 MAPK活化的western blot結(jié)果

Figure 2 The western blot results of the activation of p38 MAPK in PC12 cells

3 討論

腦卒中(stroke)是一種致死致殘率極高的嚴(yán)重疾病，隨著社會(huì)老齡化現(xiàn)象的逐漸加劇，腦卒中的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢。腦卒中一般可分為由血栓栓塞和動(dòng)脈粥樣硬化等導(dǎo)致的缺血性腦卒中(ischemic stroke)以及如嚴(yán)重高血壓和血管發(fā)育畸形等所致腦血管破裂引起的出血性腦卒中(hemorrhagic stroke)兩大類[3, 4, 11]。但二者均有相似的病理生理特點(diǎn)和臨床特征。大量基礎(chǔ)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)(inflammation)和氧化應(yīng)激(oxidative stress)與腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)元減少(包括壞死、凋亡和自噬等)密切相關(guān)，減輕和抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激對神經(jīng)元有保護(hù)作用[13, 14]。

大黃作為中國常用中草藥，具有廣泛的藥用價(jià)值，中醫(yī)認(rèn)為大黃具有"攻下積滯、清熱解毒、瀉火涼血及活血化瘀"等作用。目前臨床多用于急性胰腺炎、腎小球腎炎、急性腎功能衰竭和急性膽囊炎等炎癥相關(guān)性疾病的治療。大黃素(emodin)是中草藥大黃(rhubarb)最主要的藥理成分之一。目前研究認(rèn)為大黃素具有較為廣泛的抑制炎癥反應(yīng)的藥理作用[9, 10]。秦建華等人發(fā)現(xiàn)大黃素可以有效抑制致炎因子IL-1β誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)轉(zhuǎn)分化效應(yīng)，并具有潛在的抑制腎臟炎癥反應(yīng)作用[9]。王青等人的研究表明在人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中大黃素對內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)有明顯的抑制作用[10]。環(huán)氧酶(cyclo-oxygen-ase, COX) 是前列腺素(PGs)合成初始步驟中的關(guān)鍵性限速酶，包括COX-1 和COX-2兩種同工酶[14]。COX-1在生理狀態(tài)下具有有保護(hù)胃腸黏膜、激活血小板及維持腎、和心腦血流灌注功能等的作用，并參與巨噬細(xì)胞的分化。COX-2 具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等病理狀態(tài)時(shí)COX-2表達(dá)明顯增加，使下游的PGE2、PGH2和VEGF等炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，同時(shí)間接誘導(dǎo)氧自由基、脂氧化產(chǎn)物和活性氧等氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)的生成促進(jìn)細(xì)胞損傷[15, 16]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)COX-2與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[15, 16]。研究證實(shí)COX-2在腦卒中相關(guān)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中扮演著重要的角色，下調(diào)COX-2的表達(dá)可有效抑制神經(jīng)元的損傷和死亡[15, 16]。在本實(shí)驗(yàn)中我們使用H2O2對神經(jīng)元PC12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。在干預(yù)4小時(shí)后，PC12細(xì)胞COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，但大黃素干預(yù)的PC12細(xì)胞較未干預(yù)細(xì)胞COX-2表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明在PC12細(xì)胞中大黃素對H2O2誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)有顯著抑制作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)大黃素的抗炎癥和抗氧化應(yīng)激作用與抑制p38 MAPK的磷酸化密切相關(guān)[17, 18]。p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，對包括COX-2、TNF-α、ICMA-1和IL-8等炎癥蛋白和介質(zhì)的表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用[19, 20]。我們對PC12細(xì)胞p38 MAPK活化水平分析發(fā)現(xiàn)，在H2O2干預(yù)4小時(shí)后，PC12細(xì)胞phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明顯增加，但大黃素干預(yù)組細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平較未干預(yù)組細(xì)胞更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明在PC12細(xì)胞中大黃素可以通過抑制H2O2誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果提示，在PC12細(xì)胞中大黃素可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的COX-2合成。該基礎(chǔ)研究為大黃素應(yīng)用于腦卒中相關(guān)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激治療以及神經(jīng)元保護(hù)奠定了一定理論基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其在臨床中的價(jià)值和意義。

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Emodin Down-regulates H2O2-induced COX-2 expression by inactivation of p38 MAPK in PC12 cells

WANG hui-juan，F(xiàn)ENG She-jun，WU yan-qiang，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

Objective To explore whether emodin would inhibit H2O2-induced COX-2 expression via inactivation of p38 MAPK in neuron PC12 cells. Methods PC12 cells were divided into 3 control group, emodin+H2O2group and H2O2group. After 4 hours H2O2intervention, RT-PCR was used to measure the mRNA expression of COX-2. Meanwhile, western blot was performed to detect the protein expression of COX-2 and the ratio of phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK, which was used to analyze the activation of p38 MAPK. Results After 4 hours H2O2intervention, the mRNA and protein expression of COX-2 was noticeably up-regulated, and the phosphorylation level of p38 MAPK was sharply raised. Moreover, H2O2-induced the up-regulation of COX-2 and the raised level of phospho-p38 MAPK were both ameliorated by emodin in PC12 cells. Conclusion Emodin down-regulates the expression of COX-2 possibly via inactivation of p38 MAPK in PC12 cells.

Emodin; PC12 cells; H2O2; COX-2; p38 MAPK

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130359)

李軍濤,主任醫(yī)師。E-mail：lijuntao2014@163.com

R 915

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.005

2014-07-10； 編輯： 張文秀)