漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1及誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的影響

張艷青, 龐　磊, 吳克艷, 梁　鈺, 肖煒明, 鄧　彬

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院 消化內(nèi)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1及誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的影響

張艷青1, 龐磊1, 吳克艷2, 梁鈺2, 肖煒明2, 鄧彬2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院 消化內(nèi)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

摘要:目的觀察漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1的影響，明確漢黃芩素是否可抑制幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。方法分別在缺氧及常氧條件下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823，并在其培養(yǎng)體系中加入漢黃芩素。以ELISA法檢測(cè)胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的濃度。以胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備條件培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)磁珠分選的CD4+CD25-T細(xì)胞72 h, 流式檢測(cè)Foxp3+Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果常氧條件下，漢黃芩素對(duì)AGS細(xì)胞分泌TGF-β1無明顯抑制作用，而對(duì)BGC823細(xì)胞分泌TGF-β1有抑制作用；缺氧條件下，漢黃芩素對(duì)AGS細(xì)胞和BGC823分泌TGF-β1均有抑制作用。以常氧培養(yǎng)的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清為條件培養(yǎng)基，漢黃芩素組與溶媒組CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例無明顯差異；以缺氧培養(yǎng)的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清為條件培養(yǎng)基，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例明顯降低。結(jié)論漢黃芩素可抑制缺氧導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞TGF-β1高表達(dá)，并可抑制其誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的能力。

關(guān)鍵詞:漢黃芩素; 胃癌細(xì)胞; TGF-β1; Treg細(xì)胞; 影響

漢黃芩素(wogonin)是半枝蓮的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜和廣泛的抗腫瘤活性等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),漢黃芩素不僅具有直接的抗腫瘤作用，而且可通過影響DC、T、NK等免疫細(xì)胞活性，發(fā)揮其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡作用。本研究首先以漢黃芩素處理胃癌細(xì)胞，觀察其對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響，并以漢黃芩素處理的胃癌培養(yǎng)上清培養(yǎng)T細(xì)胞，觀察其對(duì)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的影響。

1材料與方法

1.1　試劑、細(xì)胞系及儀器設(shè)備

健康個(gè)體的外周靜脈肝素抗凝血由揚(yáng)州市血站提供；人胃癌細(xì)胞株AGS、 BGC823由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院消化病研究所惠贈(zèng)；漢黃芩素(純度>98%)購(gòu)自南京澤朗有限公司；Recombinant humanTGF-β1、recombinant mouse IL-2(R&D，美國(guó))；抗人CD3/CD28抗體包被磁珠、(Invitrogen，美國(guó))；人CD4+CD25+Treg細(xì)胞分選磁珠(Miltenyi，德國(guó)); MACS分選器、分選架、MS分選柱及LD分選柱(Miltenyi，德國(guó))；人TGF-β1ELISA檢測(cè)試劑盒(eBioscience,美國(guó))；人調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞流式檢測(cè)試劑盒(Ebioscience，美國(guó))；三氣培養(yǎng)箱(Ruskinn Works，英國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

PBMC分離、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、ELISA檢測(cè)TGF-β1、磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)方法同第3部分。

1.2.1胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基制備:取AGS及BGC823細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以每孔3×105個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板(每孔1 mL); 待細(xì)胞貼壁后，倒棄培養(yǎng)基，溶媒組加入1.5 mL含終濃度為0.4 mM NaOH的AIMV無血清培養(yǎng)基，漢黃芩素干預(yù)組調(diào)整藥物終濃度為20 μg/mL, 另設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥物及溶媒)。各組細(xì)胞分別于37 ℃, 常氧(21% O2, 5% CO2, 74% N2)及乏氧(1% O2, 5% CO2，74% N2)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞上清液，0.4 μm過濾。Control培養(yǎng)基制備: AIMV無血清培養(yǎng)基、30 U/mL recombinant IL-2。Normoxic培養(yǎng)基制備: 21% O2條件下AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清(包括溶媒組、漢黃芩素組及AIMV組)+新鮮AIMV培養(yǎng)基(1∶2混合)、30 U/mL recombinant IL-2。Hypoxic組培養(yǎng)基制備: 1% O2條件下AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清(包括溶媒組、漢黃芩素組及AIMV組)+新鮮AIMV培養(yǎng)基(1∶2混合)、30 U/mL recombinant IL-2。

1.2.2磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞：密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC), 以1640培養(yǎng)基混勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞，標(biāo)記磁珠抗體，以磁珠分選器陰性選擇分離CD4+CD25-T細(xì)胞，收集。

1.2.3ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1含量：采集細(xì)胞培養(yǎng)上清1∶50用PBS稀釋后，每100 μL樣品加入20 μL 1NHCl酸化樣品，5 min后加入20 μL NNaOH中和。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，100 μL/孔加入相應(yīng)的孔中，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。稀釋后的細(xì)胞上清按100 μL/孔加入相應(yīng)孔中，每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。密封后置于搖床上孵育2 h。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板5次，每次1 min。稀釋檢測(cè)抗體, 100 μL/孔加入相應(yīng)的孔中，密封后置于搖床上孵育1 h。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板5次，每次1 min。Avidin-HRP, 100 μL/孔加入相應(yīng)的孔中，密封后置于搖床上孵育30 min。250 μL/孔wash buffer洗滌96孔板7次，每次1 min。96孔板中加入100 μL/孔Substrate Solution, 室溫下孵育15 min。96孔板中加入50 μL/孔終止液。酶標(biāo)儀讀板。

1.3　漢黃芩素對(duì)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的影響

磁珠分選得來的CD4+CD25-T細(xì)胞分別以Control培養(yǎng)基、Normoxic培養(yǎng)基、Normoxic+ wogonin培養(yǎng)基、Normoxic+ solvent培養(yǎng)基、Hypoxic培養(yǎng)基、Hypoxic+ wogonin培養(yǎng)基、Hypoxic+ solvent培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/mL，取800 μL加入48孔板；按細(xì)胞:磁珠(5∶1)比例加入抗人CD3/CD28抗體包被的磁珠，37 ℃ 5% CO2孵育72 h。采集細(xì)胞, PBS沖洗, 300 g/min離心10 min, 孵育熒光抗體上機(jī)流式檢測(cè)。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。Students′t檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行比較。以檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　漢黃芩素抑制胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1

為了證實(shí)漢黃芩素是否影響胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1，在AGS及BGC823細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，分別加入漢黃芩素(20 μg/mL)孵育24 h，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中TGF-β1。結(jié)果顯示，常氧條件下漢黃芩素組與溶媒組AGS細(xì)胞分泌TGF-β1水平無明顯差異(P<0.05)，漢黃芩素組BGC823細(xì)胞分泌TGF-β1水平較溶媒組降低(P<0.05); 缺氧條件下漢黃芩素組AGS細(xì)胞和BGC823細(xì)胞分泌TGF-β1水平均較溶媒組降低(P<0.01)。提示漢黃芩素可抑制胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1，而在缺氧條件下這種抑制作用更為明顯。見圖1。

A.常氧條件下漢黃芩素對(duì)AGS細(xì)胞分泌TGF-β1無明顯抑制作用(#P<0.05),缺氧條件下漢黃芩素可抑制AGS細(xì)胞分泌TGF-β1(**P<0.01)B.常氧條件下漢黃芩素可抑制BGC823細(xì)胞分泌TGF-β1(*P<0.05),缺氧條件下漢黃芩素可抑制BGC823細(xì)胞分泌TGF-β1(**P<0.01)圖1 漢黃芩素抑制胃癌AGS和BGC823細(xì)胞TGF-β1分泌

2.2漢黃芩素抑制胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的能力

為了驗(yàn)證漢黃芩素是否對(duì)胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)Treg細(xì)胞有影響，作者以AGS的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)磁珠分選得來的CD4+CD25-T細(xì)胞72 h, 流式檢測(cè)CD4+Foxp3+T細(xì)胞細(xì)胞比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：常氧培養(yǎng)的AGS上清，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例無明顯差異(P<0.05); 而缺氧培養(yǎng)的AGS上清，漢黃芩素組較溶媒組CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例降低(P<0.01)。提示漢黃芩素可抑制胃癌細(xì)胞上清誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的能力。見圖2。

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)的代表性結(jié)果B.不同統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果,*P<0.05;**P<0.01圖2 漢黃芩素抑制AGS培養(yǎng)上清誘導(dǎo)Treg細(xì)胞

3討論

半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don.)別名并頭草、狹葉寒信草，為管狀花目、唇形科、黃芩屬植物，分布于阿根廷、巴西南部、烏拉圭以及中國(guó)浙江、福建、江蘇等地。全草入藥，味辛微苦，性寒，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫等功效。目前已經(jīng)從半枝蓮中分離了生物堿和黃酮類等化合物，其中漢黃芩素是半枝蓮的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。

以往研究[2-3]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可從腫瘤的血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖[4-5]、凋亡[6-8]、遷移[9-10]等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮提取物可通過下調(diào)VEGF和上調(diào)DC發(fā)揮免疫調(diào)控作用，進(jìn)而抗腫瘤[11]。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[12]發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可升高胃癌細(xì)胞SGC-7901的ROS水平激活Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。Dandawate S等[13]最近報(bào)道通過細(xì)胞模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌TGF-β1, 并進(jìn)一步阻斷TGF-β1誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的作用，提示漢黃芩素可通過靶向Treg細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。Song X等[14]的研究則發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可通過羥基化途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中HIF-1α降解，降低腫瘤細(xì)胞分泌VEGF的水平，抑制腫瘤血管生成，提示漢黃芩素或可影響缺氧相關(guān)的分子通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究的前三部分內(nèi)容證實(shí)缺氧可促進(jìn)胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1, 后者誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成，進(jìn)而抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)，而漢黃芩素的抗腫瘤機(jī)制是否涉及此級(jí)聯(lián)反應(yīng)，目前尚未見報(bào)道，本部分研究在此方面做了初步探索。

本研究中經(jīng)漢黃芩素處理的胃癌細(xì)胞AGS和BGC823，分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可抑制胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1的能力，而缺氧條件下這種抑制能力更為顯著，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道，作者推測(cè)漢黃芩素可能通過阻斷缺氧相關(guān)的分子通路而抑制TGF-β1的表達(dá)。本研究進(jìn)一步以漢黃芩素處理的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)CD4+CD25-T細(xì)胞，繼而以流式技術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞比例，作者發(fā)現(xiàn)對(duì)于常氧條件下培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，漢黃芩素處理與否對(duì)其誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的能力并沒有明顯影響，而對(duì)于缺氧培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，漢黃芩素可明顯降低其誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的能力。結(jié)合以往研究，作者推測(cè)漢黃芩素可通過下調(diào)缺氧條件下胃癌細(xì)胞TGF-β1的分泌水平，抑制其誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的能力，此機(jī)制可能為漢黃芩素抗腫瘤效應(yīng)的重要組成部分。

綜上所述，初步的研究結(jié)果證實(shí)漢黃芩素可抑制缺氧導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞分泌TGF-β1，并可部分阻斷其對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。而體內(nèi)漢黃芩素是否影響腫瘤缺氧相關(guān)的分子通路及機(jī)體的免疫調(diào)控，尚不得而知。因而，尚需要設(shè)計(jì)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來驗(yàn)證漢黃芩素是否通過調(diào)控機(jī)體免疫來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，以期為其用于臨床腫瘤治療提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]楊莉, 尤啟冬, 楊勇, 等. 漢黃芩素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(6): 576.

[2]Zhou M, Song X, Huang Y, et al. Wogonin inhibits H2O2-induced angiogenesis via suppressing PI3K/Akt/NF-kappaB signaling pathway[J]. Vascul Pharmacol,2014，60: 110.

[3]徐敏, 卜平, 李瑤瑤. 半枝蓮黃酮類化合物對(duì)體外腫瘤血管生成的影響[J]. 世界華人消化雜志, 2007, 15(20): 2215.

[4]史志如, 尚斐, 張媛, 等. 漢黃芩素對(duì)MCF-7細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26(5): 696.

[5]孫健, 張揚(yáng), 溫慶輝, 等. 漢黃芩素對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖和周期的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2010, 16(18): 169.

[6]Kim M S, Bak Y, Park Y S, et al. Wogonin induces apoptosis by suppressing E6 and E7 expressions and activating intrinsic signaling pathways in HPV-16 cervical cancer cells[J]. Cell Biol Toxicol,2013,29: 259.

[7]Wang C Z, Calway T D, Wen X D, et al. Hydrophobic flavonoids from Scutellaria baicalensis induce colorectal cancer cell apoptosis through a mitochondrial-mediated pathway[J]. Int J Oncol, 2013, 42: 1018.

[8]Huang K F, Zhang G D, Huang Y Q, et al. Wogonin induces apoptosis and down-regulates survivin in human breast cancer MCF-7 cells by modulating PI3K-AKT pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2012，12: 334.

[9]黃愷飛, 黃亦琦. 漢黃芩素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞黏附和遷移能力的影響及其可能機(jī)制[J]. 腫瘤, 2011, 31(1): 34.

[10]李現(xiàn)東. 漢黃芩素對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的體外作用研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 36(7): 790.

[11]宋增芳, 廖月霞, 肖煒明, 等. 半枝蓮水提取物調(diào)節(jié)腫瘤VEGF/DC實(shí)驗(yàn)研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2011, 15(19): 1.

[12]吳克艷, 肖煒明, 龔衛(wèi)娟, 等. 漢黃芩素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡中活性氧水平和半胱氨酸蛋白酶-3活性變化[J]. 中華消化雜志, 2012, 32(7): 477.

[13]Dandawate S, Williams L, Joshee N, et al. Scutellaria extract and wogonin inhibit tumor-mediated induction of T(reg) cells via inhibition of TGF-beta1 activity[J]. Cancer Immunol Immunother, 2012, 61: 701.

[14]Song X, Yao J, Wang F, et al. Wogonin inhibits tumor angiogenesis via degradation of HIF-1alpha protein[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013, 271: 144.

Influence of wogonin on TGF-β1secretion of gastric cancer cells and induction of Tregs

ZHANG Yanqing1, PANG Lei1, WU Keyan2, LIANG Yu2,

XIAO Weiming2, DENG Bin2

(1.MedicalCollegeofYangzhouUniversity，Yangzhou,Jiangsu, 225001;

2.DepartmentofGastroenterology,ThesecondClinicalSchoolofYangzhouUniversity,

Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe influence of wogonin on TGF-β1secretion of gastric cancer cells and to verify whether wogonin inhibits the ability of inducing CD4+Foxp3+T cells via TGF-β1.Methods Human gastric cancer cell lines, AGS and BGC823 were cultured in 5% CO2at 37 ℃ for 24 hours under hypoxic (1.0% O2) or normoxic (21% O2) conditions. Wogoins were added into AGS and BGC823 cell culture system for 24 hours. TGF-β1concentration in culture supernatants were detected by ELISA. The supernatants collected from cultured AGS and BGC823 cells were made into condition medium to culture isolated CD4+CD25-T cells. Flow cytometry were used to detect the Foxp3+Tregs.ResultsUnder normoxic conditions, Wogonin affected TGF-β1secretion of AGS cells, but inhibited TGF-β1secretion of BGC823 cells. Under hypoxic conditions,wogonin inhibited TGF-β1secretion both of BGC823 cells and AGS cells. Cultured in normoxic condition meidiums, there were no significant difference of CD4+Foxp3+T cells proportion between wogonin and solvent groups. Cultured in hypoxic condition meidiums, the proportion of CD4+Foxp3+T cells in wogonin groups was lower than that in solvent groups. ConclusionWogonin can not only suppress TGF-β1expression caused by hypoxia in gastric cancer cells, but also inhabit the induction of Tregs.

KEYWORDS:wogonin; gastric cancer cells; TGF-β1; Treg cells; influence

基金項(xiàng)目:江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(12KJD320007)

收稿日期:2015-06-28

中圖分類號(hào):R 735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)21-020-04DOI: 10.7619/jcmp.201521006