基因芯片技術在乙肝病毒分型和耐藥突變檢測中的應用

李延武, 李卓成

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗科, 廣東 深圳, 518035)

基因芯片技術在乙肝病毒分型和耐藥突變檢測中的應用

李延武, 李卓成

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗科, 廣東 深圳, 518035)

摘要:目的探討基因芯片技術在乙肝病毒(HBV)分型和耐藥突變檢測中的應用。方法采用基因芯片法檢測105例HBV病毒攜帶者血清標本，觀察HBV基因分型特點及針對核苷酸類藥物的耐藥突變情況，并結合受試者熒光定量PCR病毒載量、血清HBV標志物及病理檢測結果進行分析。結果105例HBV病毒攜帶者C型63例(60.0%), B型、C型混合型16例(15.2%), B型26例(24.8%), 各基因型構成差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C型HBV-DNA載量對數(shù)值、HBeAg陽性率與B型比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。病理活檢結果顯示炎癥分期G3～G4期、纖維化分級S3～S4級C型乙肝病毒攜帶者所占比重高于B型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。共檢出耐藥突變28例(26.67%); 204I居多，占11.4%, 180M+204V+204I突變共7例，占6.67%。臨床耐藥種類表現(xiàn)為拉米夫定耐藥26例，阿德福韋耐藥2例。結論基因芯片技術對乙肝病毒分型及耐藥突變檢測具有重要的作用。

關鍵詞:乙型肝炎病毒; 基因芯片; 基因分型; 耐藥突變

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球性流行，中國為乙型肝炎的重要疫區(qū)，HBV病毒攜帶者約占中國總人口的5%～20%, 每年因慢性乙型肝炎導致的肝硬化、肝癌而死亡的人數(shù)將近30萬[1]。HBV病毒根據(jù)全基因序列同源性大于92%及S基因系列同源性大于96%分為8種基因型，各基因型的地理、種族分布及耐藥特點均有不同，并直接影響到疾病的臨床表現(xiàn)及治療效果。作者應用基因芯片技術對105例HBV病毒攜帶者進行了檢測，旨在研究本院乙肝病毒基因分型特點及針對核苷酸類藥物耐藥突變情況，為乙型肝炎的防治提供臨床研究資料。

1資料與方法

1.1　研究對象

選取2012年1月—2014年1月本院傳染科收治的HBV病毒攜帶者105例為研究對象，所有患者均簽署知情同意書，其中男64例，女41例，年齡28～46歲。納入標準: ① 所有研究對象乙肝表面抗原(HBsAg)與HBV-DNA檢測均為陽性結果; ② 均進行肝組織病理活檢。研究對象的選擇注意排除除乙型肝炎病毒外其他型別肝炎病毒感染患者，并排除免疫性肝病，膽汁型肝硬化患者。

1.2　研究方法

對105例HBV病毒攜帶者清晨空腹取血4 mL于含促凝劑試管各3支，分別進行基因芯片法檢測HBV基因分型(A-H)及耐藥突變(184G、181V、236T、194T、180M、204V、204I、202G、250V)；熒光定量PCR檢測HBV病毒DNA載量；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測乙肝血清標志物；并對研究對象進行肝組織病理活檢，研究HBV基因分型(A-H)與HBV病毒DNA載量、乙肝e抗原(HBeAg)陽性情況及肝組織病理活檢肝組織炎性分級(G0～G4)、肝纖維化(S0～S4)之間關系，并觀察105例乙肝病毒攜帶者HBV病毒耐藥突變情況。

1.3　實驗室檢測

1.3.1基因芯片:HBV基因分型及耐藥突變檢測試劑采用珠海賽樂奇生物有限公司生產(chǎn)產(chǎn)品，全自動基因擴增儀為ABI7300，分子雜交儀為FYY-3型，嚴格按試劑說明操作，擴增循環(huán)條件95 ℃10 min→94 ℃30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s(50個循環(huán))。

1.3.2熒光定量PCR: HBV病毒DNA載量檢測采用熒光定量PCR方法，試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供，全自動基因擴增儀為ABI7500, 擴增循環(huán)條件: 93 ℃ 2 min→93 ℃ 45 s, 55 ℃ 60 s(10個循環(huán))→93 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s(30個循環(huán))，分析后擴增曲線調(diào)節(jié)Baseline的start值、end值以及threshod，根據(jù)標準曲線自動定量，對于CT值處于27-30的灰值區(qū)域標本，進行重新取血復查。

1.3.3HBV血清標志物:ELISA檢測HBV血清標志物，試劑使用萬泰生物有限公司產(chǎn)品，全自動免疫分析儀為深圳愛康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的URANUS120，嚴格按試劑說明書操作。

1.4　病理檢查

由相關臨床高資歷醫(yī)生超聲引導行肝組織取材，送病理活檢，肝組織炎癥分級及纖維化分期參照《病毒性肝炎防治方案》[2]的相關診斷。

1.5　統(tǒng)計學處理

使用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，多組間均值比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，構成比、構成率比較采用卡方檢驗，以P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1　105例HBV病毒攜帶者基因分型情況

105例HBV病毒攜帶者基因芯片檢測基因分型: C型63例(60.0%), B型、C型混合型16例(15.2%),B型26例(24.8%), 各不同基因型構成比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=52.54，P=0.000), 其中以C型為主要型別。

2.2　不同基因型別HBV病毒攜帶者HBV-DNA根據(jù)不同基因型分組比較各組HBV病比較

根據(jù)不同基因型分組比較各組HBV病毒攜帶者HBV-DNA載量對數(shù)值、HBeAg陽性率及病理活檢，HBV-DNA載量對數(shù)值3組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), SNK兩兩比較3組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 其中以C型HBV-DNA載量對數(shù)值較高; HBeAg陽性率3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 兩兩比較C型HBeAg陽性率與B型差異有統(tǒng)計學意義，其他各組比較無顯著差異(P>0.05)。病理活檢經(jīng)卡方檢驗分析比較，炎癥分期、纖維化分級均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 炎癥分期G3～G4期，纖維化分級S3～S4級C型乙肝病毒攜帶者所占比重高于B型及B、C混合型。見表1。

2.3　105例HBV病毒攜帶者針對核苷酸類藥物耐藥突變檢測情況

105例HBV病毒攜帶者針對核苷酸類藥物耐藥突變基因芯片檢測情況見表2, 其中共檢出耐藥突變28例，占26.67%; 204I居多占11.4%, 180M+204V+204I突變居第2位，共7例，占6.67%; 臨床耐藥種類表現(xiàn)為拉米夫定耐藥26例，阿德福韋耐藥2例。

表1　不同基因型別HBV病毒攜帶者HBV-DNA載量對數(shù)值、

與C型比較，*P<0.05; 與B+C型比較，#P<0.05。

表2　105例HBV病毒攜帶者針對核苷酸類藥物耐藥

3討論

HBV基因型別的多態(tài)性源于其逆轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶校正功能的缺失，基因序列以點突變多見[3], 包括自然變異、抗病毒藥物以及機體免疫應答導致的變異，變異長期累積形成HBV病毒基因序列的差異性，也是病毒變異進化的一種形式，目前根據(jù)基因序列差異性(全基因序列≥8%、S基因系列≥4%)分為常見的8種基因型(A-H), 各基因型又可分為不同亞型，中國以B、C、D這4種型別多見。各型別地域差異性較大, B型南方多見，而北方則以C型為主，本研究僅檢測出B型、C型兩種型別，其中以C型為主占60.0%, B、C混合感染占15.2%, 符合上述觀點，混合型感染比率升高在其他研究中也有報導[4], 其因素考慮與人口流動性有關。

病毒基因控制相關抗原的表達，基因不同的毒株有不同的抗原表達特點，病毒變異的結果也導致宿主免疫應答以及患者臨床表現(xiàn)的多樣性，病情趨向于復雜化，也給臨床的治療提供了難度。相關研究[5]顯示, C型HBV病毒引起的肝損重于B型病毒，作者對研究中不同型別乙肝病毒攜帶者HBV-DNA病毒載量對數(shù)值以及HBeAg陽性率進行了比較，研究顯示C型HBV-DNA病毒載量對數(shù)值以及HBeAg陽性率均高于B型，差異均有統(tǒng)計學意義。病例活檢結果顯示，C型肝組織炎癥分期以G3～G4居多，與B型分布差異有統(tǒng)計學意義，纖維化分級以S3～S4居多，與其他2組均有顯著差異。數(shù)據(jù)說明在重型肝炎及肝纖維化程度較高患者中，C型占較大比重。有學者[6]認為C型HBV病毒較難清除，易形成持續(xù)的病毒血癥，預后較差。

乙肝的治療目前采用核苷類藥物及干擾素治療較為多見，常見核苷類藥物包括拉米夫定及阿德福韋脂，核苷類藥物對延緩肝炎病情進展及改善組織學病變有良好的治療效果，但長期治療過程中易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象為其共同的局限性[7-9]。本研究中耐藥突變率為26.67%, 突變類型以204I、180M+204V+204I、180M+204V多見，臨床表現(xiàn)為拉米夫定耐藥，204I、204V均位于聚合酶C區(qū)，這一區(qū)域為拉米夫定的作用靶點，HBV野生型為蛋氨酸(M)，突變株被異亮氨酸(I)及纈氨酸(V), 其點突變分別為739位堿基鳥嘌呤(G)取代腺嘌呤(A)及741位堿基胸腺嘧啶(T)取代鳥嘌呤(G), 異亮氨酸及纈氨酸取代蛋氨酸誘發(fā)拉米夫定耐藥。資料[10-11]顯示，拉米夫定為耐藥率較高的核苷類藥物，且用藥時間越長，耐藥率越高，用藥4年的耐藥率可達66%; 另阿德福韋脂臨床報導耐藥率較低，對于e抗原陽性患者三年的耐藥僅為3.1%[12], 但本研究中發(fā)現(xiàn)2例，值得引起臨床的關注。

基因芯片為采用光導原位合成及顯微印刷將大量特定序列探針固密集有序的固定與載體上，通過多元雜交進行定性及定量的方法，微型化、集成化、高通量，平行化及敏感性強為其主要特點[13-14], 可同時檢測多個基因改變。基因芯片對乙肝病毒分型及耐藥突變檢測在乙肝防治上有重要的臨床意義，值得推廣應用。

參考文獻

[1]劉文有. 乙型肝炎流行病學研究概況[J]. 內(nèi)科, 2012, 7(3): 299.

[2]中華醫(yī)學會肝病學分會, 中華醫(yī)學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)[J]. 中華肝臟病雜志, 2011, 19(1): 13.

[3]Devesa M, Loureiro C L, Rivas Y, et al. Subgenotype diversity of hepatitis B virus American genotype F in Amerindians from Venezuela and the general population of Colombia[J]. J Med Virol, 2008, 80(1): 20.

[4]金暉, 王杰, 閆玲, 等. 乙型肝炎病毒A-D基因型及B1、B2、C1和C2基因亞型巢式聚合酶鏈反應分型法的建立[J]. 中華流行病學雜志, 2008, 29(12): 235.

[5]孫珍, 趙志軍, 師志云, 等. 寧夏地區(qū)乙肝病毒感染者HBV基因分型與臨床意義[J]. 寧夏醫(yī)科大學學報, 2014, 1(1): 34.

[6]鐘大妮, 李國堅, 吳繼周, 等. 廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型與臨床表現(xiàn)及機體免疫功能關系的研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新, 2013, 10(2): 1.

[7]Lok A S, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management[J]. Hepatology, 2007, 46(1): 254.

[8]郭建瓊, 程玲, 劉洪利, 等. 163例慢性重型乙型病毒性肝炎合并自發(fā)性細菌性腹膜炎的臨床分析[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2011, 33(21): 2240.

[9]金生. 慢性乙型肝炎抗病毒治療—2012年歐洲肝病研究學會指南簡介[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2013, 33(3): 193.

[10]宋曉西. 護理干預對乙肝患者抗病毒治療依從性的影響[J]. 中華全科醫(yī)學, 2011, 9(9): 1479.

[11]李文鵬, 李彤, 莊輝. 乙型肝炎病毒對拉米夫定耐藥的研究進展[J].傳染病信息, 2007, 20(1): 32.

[12]Seyed H, Monavari H, Keyvani H, et al. Detection of rtN236T mutation associated with adefovir dipivoxil resistance in Hepatitis B infected patients with YMDD mutations in Tehran[J]. Iranian journal of microbiology, 2013, 5(1): 76.

[13]李金明, 謝南, 熊德琴.基因芯片法檢測乙肝病毒多位點變異的臨床應用[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學, 2009, 27(6): 615.

[14]李延武. 利用基因芯片技術研究乙肝病毒耐藥機制[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志, 2012, 21(12): 1303.

Application of gene chip technology in hepatitis B

virus genotyping and detection of resistance mutations

LI Yanwu, LI Zhuocheng

(DepartmentofLaboratory,ShenzhenSecondPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518035)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the application of gene chip technology in hepatitis B virus (HBV) genotyping and detection of resistance mutations. MethodsA total of 105 serum samples of patients with HBV were detected by gene chip method. Feature of HBV genotyping and drug resistance to the nucleotide drugs were observed and analyzed in the condition of considering with the subjects quantitative PCR viral load, serum HBV markers and pathological test results. ResultsOf 105 patients with HBV virus, 63 cases were type C (60.0%), 16 cases were mixed type of B and C (15.2%), 26 cases were type B (24.8%), and there were significant differences among all the genotypes (P<0.05). There were significant differences in HBV-DNA load logarithm and positive rate of HBeAg between type B and type C (P<0.05). Biopsy result revealed that ratio of type C patients with staging G3～G4and fiber S3～S4class of HBV was significantly higher than that of type B patients (P<0.05). Resistance mutations were detected in 28 cases (26.67%). 204I mutation was the most, accounted for 11.4%. 180M +204 V +204 I mutation was observed in 7 cases (6.67%). Clinical manifestations of resistance to drug were lamivudine-resistant species in 26 cases and adefovir resistance in 2 cases. ConclusionGene chip technology shows an important role in the HBV genotyping and detection of resistance mutations.

KEYWORDS:hepatitis B virus; gene chip; genotyping; resistance mutations

基金項目:廣東省深圳市科技計劃項目(201003037)

收稿日期:2014-12-09

中圖分類號:R 512.6

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-049-03

DOI:10.7619/jcmp.201509014