紅花抗早孕作用及對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響※

宋小青　安　民　陳春暉　李丹丹　魏會(huì)平

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，河北　張家口　075000)

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紅花抗早孕作用及對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響※

宋小青安民陳春暉李丹丹魏會(huì)平

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，河北張家口075000)

【摘要】目的研究紅花抗早孕作用及對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響，并觀察其毒理作用。方法將60孕鼠平均分為紅花低、中、高劑量組及空白對(duì)照組，每組15只。紅花低、中、高劑量組分別按相當(dāng)于生藥量1、3、5 g/kg紅花單品水煎劑灌胃，空白對(duì)照組每日予等容積蒸餾水灌胃。另選28只未孕雌鼠，分組及灌胃方法同孕鼠組。比較各孕鼠組止孕率及子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)情況，并觀察各未孕組小鼠體質(zhì)量增長情況，評(píng)價(jià)紅花毒理作用。結(jié)果紅花低、中、高劑量組止孕率較空白對(duì)照組均明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨紅花劑量增加止孕效果越明顯(P<0.05)；紅花低、中、高劑量組孕鼠VEGF在子宮內(nèi)膜IOD值均低于空白對(duì)照組，但僅紅花中、高劑量組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅花低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；紅花低、中、高劑量組灌胃前后體質(zhì)量增長率均低于空白對(duì)照組，但僅紅花高劑量組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅花低、中劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論紅花能明顯降低孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)水平，影響胚胎血管的形成，從而起到抗早孕的作用，且無明顯毒副作用。

紅花為一年生草本植物，其藥用部分為干燥花。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，紅花味辛微苦，性溫，歸心、肝經(jīng)，是活血通絡(luò)、祛瘀止痛之良藥[1]，常被用作抗早孕藥方的組份之一[2-3]。近年來對(duì)單味紅花煎劑抗早孕作用機(jī)制的研究也日益深入[4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)對(duì)胚胎生長發(fā)育具有關(guān)鍵作用，Rabbani ML等[5]研究顯示，給交配后的大鼠注射抗VEGF抗體，其植入率及內(nèi)皮細(xì)胞增殖率均明顯降低。胡瑞華等[6]通過對(duì)比早期自然流產(chǎn)組和正常妊娠組孕婦血清VEGF的表達(dá)情況顯示，早期自然流產(chǎn)組外周血中VEGF的水平顯著低于正常早孕組(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究紅花對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其抗早孕的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明系成熟小鼠150只，其中雄性30只，雌性120只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(27.6±2.2)g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SXCK-(軍)-2012-0004。

1.2主要藥品、試劑及儀器紅花(河北華佗藥房連鎖有限公司)，經(jīng)河北北方學(xué)院魏會(huì)平教授鑒定備用；VEGF兔抗小鼠一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；YP502N型電子天平(上海飄深機(jī)械有限公司)；SPX智能型溫箱(寧波江南儀器廠)；LEICA RMZ135型石蠟切片機(jī)(德國萊卡儀器有限公司)；OLYMPUS顯微鏡成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1抗早孕實(shí)驗(yàn)取120只小鼠(雌雄比為3∶1)合籠過夜，次日晨檢，將有陰栓者取出定為妊娠第1 d，連續(xù)觀察4 d，并按妊娠日期分組飼養(yǎng)。隨機(jī)取60只孕鼠平均分為紅花低、中、高劑量組及空白對(duì)照組，每組15只。紅花低、中、高劑量組分別按相當(dāng)于生藥量1、3、5 g/kg紅花單品水煎劑灌胃，于妊娠第6 d開始，早、晚各1次，連續(xù)給藥3 d；空白對(duì)照組每日予等容積蒸餾水灌胃。

1.3.2紅花毒理作用觀察通過觀察紅花對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響，判斷紅花的毒理作用。隨機(jī)選取未作受孕處理且體態(tài)較為接近的28只雌性小鼠，連續(xù)喂養(yǎng)5 d后隨機(jī)分為4組，每組7只，并記錄各組小鼠體質(zhì)量。分組及給藥方法同1.3.1“抗早孕實(shí)驗(yàn)”，10 d后分別稱質(zhì)量，比較各組小鼠體質(zhì)量增長率的差別。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1止孕情況比較給藥期間密切觀察各組孕鼠是否有陰道出血、流產(chǎn)及早產(chǎn)等止孕現(xiàn)象，均于妊娠第10 d處死，剖檢孕鼠子宮，統(tǒng)計(jì)并比較各組止孕率。

1.4.2VEGF表達(dá)分析取各組孕鼠子宮制作組織切片，將切片常規(guī)脫蠟至水，滴加雙氧水(H2O2)于37 ℃孵育15 min；加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高壓修復(fù)10 min，自然冷卻；滴加非免疫山羊血清封閉液，孵育10 min，傾去封閉液，取VEGF工作液(即按1∶1 000稀釋抗體原液)滴加于相應(yīng)的載玻片，4 ℃過夜孵育；滴加二抗(山羊抗兔)，孵育15 min；滴加SP溶液，孵育10 min。以上各步驟間，除“傾去封閉液”以外，其他步驟結(jié)束后均需磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，最后DAB顯色10 s，經(jīng)脫水、透明并封片后進(jìn)行分析。每組隨機(jī)取3張切片，采用OLYMPUS顯微鏡成像系統(tǒng)拍攝照片，然后采用Image-Pro Plus 610圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析,每張切片隨機(jī)選定5個(gè)不重疊的視野，分別測(cè)量陽性染色部位的積分光密度值(IOD)，IOD值越大代表VEGF表達(dá)越強(qiáng)。

2結(jié)果

2.1各組孕鼠止孕情況比較連續(xù)給藥6次后，剖腹觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組孕鼠子宮壁明顯變薄，且有明顯串珠樣隆起，呈正常的肉粉色；紅花低、中、高劑量組孕鼠子宮頸有所增粗，但囊胚串珠隆起不明顯或消失，顏色偏暗紅。解剖子宮發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組胚胎紅潤光滑，呈豌豆粒大?。患t花低、中、高劑量組孕鼠子宮內(nèi)則呈現(xiàn)胚胎少、死胎、淤血甚至是無胚胎等止孕現(xiàn)象，且隨劑量增加越明顯。各組孕鼠止孕情況比較見表1。

表1　各組孕鼠止孕率比較　只

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與紅花低劑量組比較，△P<0.05；與紅花中劑量組比較，#P<0.05

由表1可見，紅花低、中、高劑量組止孕率較空白對(duì)照組均明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨紅花劑量增加止孕效果越明顯(P<0.05)。

2.2各組孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)情況比較VEGF在子宮內(nèi)膜的表達(dá)主要定位于腺上皮細(xì)胞核及其胞質(zhì)內(nèi)，而在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)則較少，免疫組化后(DAB染色)細(xì)胞內(nèi)將出現(xiàn)棕黃色顆粒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可見明顯的棕黃色沉淀，呈強(qiáng)陽性；而在藥物作用下，紅花低、中、高劑量組孕鼠子宮蛻膜上皮細(xì)胞中棕黃色染色強(qiáng)度呈減弱趨勢(shì)，紅花高劑量組染色強(qiáng)度最弱。各組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值比較見表2。

表2　各組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值比較±s

與對(duì)照組比較，*P<0.05

由表2可見，紅花低、中、高劑量組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值均低于空白對(duì)照組，但僅紅花中、高劑量組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅花低劑量組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3紅花的毒理作用觀察見表3。

由表3可見，紅花低、中、高劑量組灌胃前后體質(zhì)量增長率均低于空白對(duì)照組，但僅紅花高劑量組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅花低、中劑量組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明紅花對(duì)小鼠體質(zhì)量增長影響并不明顯，僅高劑量組有一定影響。

表3　紅花的毒理作用觀察　%，±s

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

3討論

妊娠時(shí)期原始血管的形成主要源于VEGF通過與其特異受體結(jié)合促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲蛻膜及完成對(duì)血管重塑過程[7]。豐富而完善的血管網(wǎng)絡(luò)有利于母胎之間正常的物質(zhì)交換，從而促進(jìn)胚胎正常發(fā)育，因此蛻膜中血管的發(fā)育和形成對(duì)正常妊娠有十分重大意義。VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自然流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用，研究表明，早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF表達(dá)水平降低，而其可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(sFlt-1)的表達(dá)水平則升高，提示VEGF和sFlt-1可能與早期自然流產(chǎn)有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，紅花對(duì)各組孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)具有明顯抑制作用，且隨著劑量的增加而抑制作用增強(qiáng)，且其抑制作用可能與有效成分羥基紅花黃色素有關(guān)[8-9]。

現(xiàn)代研究顯示，紅花對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞有較強(qiáng)的選擇性興奮作用[10]，小劑量可使離體或在體子宮發(fā)生節(jié)律性收縮，大劑量則容易導(dǎo)致收縮頻率加強(qiáng)，甚至引起痙攣，對(duì)妊娠動(dòng)物的作用尤其明顯，故易引起出血和流產(chǎn)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，紅花低、中、高劑量組均具有明顯的抗早孕作用，且隨著劑量的增加止孕率越高。

另外，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，紅花對(duì)小鼠體質(zhì)量增加影響不大，且先前研究也證明紅花對(duì)紅細(xì)胞無溶解作用[13]，故推測(cè)一定劑量的紅花對(duì)健康影響不大。同時(shí)，馬保華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，紅花抗早孕治療后，停藥10 d左右實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自動(dòng)恢復(fù)動(dòng)情周期，交配生仔，不影響再孕。

綜上所述，紅花能明顯降低孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)水平，影響胚胎血管的形成，從而起到抗早孕的作用，且無明顯毒副作用，可考慮在適當(dāng)劑量范圍內(nèi)擴(kuò)大臨床計(jì)劃生育工作中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1]肖艷華，崔猛，李艷艷.紅花的化學(xué)成分[J].武漢

工程大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(3):15-17.

[2]馬保華,趙偉,王哲民,等.復(fù)方紅花對(duì)地鼠的抗早孕作用與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凝集素受體表達(dá)的相關(guān)性研究[J].生殖與避孕,2001,21(4):237-240.

[3]賈玲，李愛蓉，呂向華，等.復(fù)方口服中藥催經(jīng)止孕的臨床觀察[J].臨床醫(yī)學(xué)，2001，21(2):54-55.

[4]廉瑞青,禹卉,王哲民,等.中藥紅花對(duì)白血病抑制因子在小鼠早孕子宮內(nèi)膜表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007,45(1):68-70.

[5]Rabbani ML，Rogers PA.Role of vascular endothelial growth factor in endometrial vascular events before implantation in rats[J].Reproduction，2001，122(1):85-90.

[6]胡瑞華,李偉莉.早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF、sFlt-1水平的變化及意義[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24(7):625-626.

[7]彭軟，游澤山，蘇秀梅，等.血管內(nèi)皮生長因子及胎盤微血管密度與自然流產(chǎn)的相關(guān)性[J].廣東醫(yī)學(xué)，2009，30(12):1870-1872.

[8]謝軍平，高亭，李環(huán)羽，等.羥基紅花黃色素A對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及VEGF表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(1):36-38.

[9]張前，牛欣，閆妍，等.羥基紅花黃色素A抑制新生血管形成的機(jī)制研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(3):25-29.

[10]石米揚(yáng),昌蘭芳,何功倍.紅花、當(dāng)歸、益母草對(duì)子宮興奮作用的機(jī)理研究[J].中國中藥雜志,1995,20(3):173-175.

[11]董玉睿.淺談西紅花的藥理研究概況[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，19(2):53-55.

[12]林邦和,嚴(yán)冬,周立人,等.紅花對(duì)大鼠妊娠和胚胎發(fā)育的毒性和影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,17(4):50-52.

[13]宋小青，魏會(huì)平，李丹丹，等.中藥紅花抗小鼠早孕的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2014，36(11):2408-2410.

(本文編輯：石康)

【關(guān)鍵詞】紅花；抗早孕；血管內(nèi)皮生長因子；毒理作用

※項(xiàng)目來源：河北省科學(xué)技術(shù)廳自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(編號(hào)：12272503)

Effect of anti-early pregnancy function of Honghua in early pregnant mice and its effect on vascular endothelial growth factor in endometriumSONGXiaoqing,ANMin,CHENChunhui,etal.DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciencesofHebeiNorthUniversityHebei,Zhangjiakou075000

【Abstract】Objective To effect the anti-early pregnancy function of Honghua in early pregnant mice and its effect on vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometrium, and to observe the toxicological effect. Methods 60 pregnant mice were averagely divided into Honghua low, middle, high dose group and blank control group, 15 mice in each group. Mice in Honghua low, middle, high dose group were received Honghua decoction which equivalent of 1, 3, 5 g/kg of cure drug respectively, via gavage. Mice in blank control group were received equivalent volume distilled water via gavage. Then took another 28 unpregnant female mice which received same grouping method and gavage method as pregnant mice group. The terminating pregnancy condition and the expression of VFGF in endometrium were observed in each pregnant mice group. The increase of body mass was observed in unpregnant group, and the toxicological effect of Honghua was evaluated. Results The terminating pregnancy rates in Honghua low, middle and high dose group was obviously increased as compared with those in blank control group, there were significant differences (P<0.05), and the terminating pregnancy effect increase with dosage of Honghua (P<0.05).The integrated optical density (IOD) of endometrium VEGF in Honghua low, middle and high dose group was lower than that in blank control group, but the statistical difference on IOD only among Honghua middle, high dose group and blank control group (P<0.05), there was no statistical difference on IOD between Honghua low dose group and blank control group (P>0.05). The growth rate of body mass before and after lavage in Honghua low, middle and high dose group was lower than that in blank control group, but the statistical difference on body mass only between Honghua high dose group and blank control group (P<0.05), there was no statistical difference on on body mass among Honghua low, middle dose group and blank control group (P>0.05). Conclusion Honghua can significantly decrease the expression of endometrium VEGF in pregnant mice, affect the formation of embryonic vascular, play a role in anti-early pregnancy and without evident toxic effects.

【Key words】Honghua; Anti-pregnancy; Vascular endothelial growth factor; Toxicological effect

(收稿日期：2014-10-23)

作者簡(jiǎn)介：宋小青(1978—)，女，講師，碩士。從事細(xì)胞遺傳學(xué)研究及教學(xué)工作。

【中圖分類號(hào)】R715.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2015)12-1836-04

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.023