禽流感檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

黃俊姿

烏蘭察布市集寧區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

禽流感檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

黃俊姿

烏蘭察布市集寧區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一種禽類(lèi)的感染疾病綜合征，不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。由于流感病毒具有亞型多、抗原變異性較強(qiáng)和宿主范圍廣等特點(diǎn)。因此，建立一種快速、有效的流感病毒檢測(cè)方法就顯得非常重要。文章就目前流感病毒的檢測(cè)技術(shù)，包括診斷做一綜述，為了有效控制禽流感的發(fā)生與流行提供有力的技術(shù)支撐。

禽流感檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

一、禽流感概述

1887年，意大利首次發(fā)現(xiàn)禽流感，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定的A類(lèi)傳染病，中國(guó)也已將此病納入一類(lèi)傳染病［1］。禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的一種禽類(lèi)傳染病，雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽均可感染，發(fā)病情況差別較大，有的出現(xiàn)急性死亡，有的無(wú)癥狀帶毒。根據(jù)病毒核蛋白與基質(zhì)蛋白的抗原性及其基因特性的不同，流感病毒可分為A、B、C型。禽流感病毒屬于A型流感病毒，可感染人、馬和豬及其他哺乳動(dòng)物，家禽和野生禽類(lèi)，禽流感一旦暴發(fā)往往給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)毀滅性的打擊，并且嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。因此，建立一種快速、高效的檢測(cè)方法是預(yù)防禽流感的重要途徑。

二、禽流感流行病學(xué)概括

高致病性禽流感主要病毒亞型為H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4和H7N7。其中HPAI的主要特征是突然死亡和高死亡率，可以導(dǎo)致感染禽類(lèi)的大量死亡。1983年美國(guó)澤西州、弗吉尼亞州和賓夕法尼亞州暴發(fā)禽流感，共計(jì)1250萬(wàn)只家禽被捕殺；1995年墨西哥發(fā)現(xiàn)的低致病性H5N2亞型流行株突變成高致病力毒株，波及12個(gè)州，共淘汰1800萬(wàn)只雞，封鎖3200萬(wàn)只雞，1.3億只雞被緊急接種疫苗；2003年荷蘭暴發(fā)了H7N7亞型的高致病性禽流感，大約有3000多萬(wàn)只禽類(lèi)被捕殺；2003年底至2004年初，越南、泰國(guó)、韓國(guó)和中國(guó)等10多個(gè)國(guó)家相繼暴發(fā)H5N1禽流感，在幾個(gè)月的時(shí)間里，共有一億多禽類(lèi)死于此種疾病或是被捕殺。

1997年我國(guó)香港地區(qū)相繼有18人感染H5N1病毒，其中6人死亡，此次感染人的病毒與香港雞場(chǎng)暴發(fā)的HPAIV密切相關(guān)。2003年我國(guó)香港再次發(fā)生H5N1直接感染人事件，感染2例，1例死亡。2003年荷蘭Gelderland省暴發(fā)高致病性禽流感H7N7，此次AIV暴發(fā)中確認(rèn)的83例，感染者大多數(shù)是獸醫(yī)和農(nóng)場(chǎng)工作人員。從1例死于急性呼吸窘迫癥的患者體內(nèi)分離到H7N7病毒，未發(fā)現(xiàn)其他呼吸道病原。特別是2003年12月以來(lái)，越南、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家先后暴發(fā)了大規(guī)模H5N1高致病性禽流感，在整個(gè)流行期間，越南共有22人確診感染了H5N1高致病性禽流感，其中15人死亡，泰國(guó)12人感染，其中8人死亡，在越南還出現(xiàn)了人與人之間傳染禽流感的疑似病例。2007年，印度尼西亞再一次暴發(fā)了H5N1高致病性禽流感感染人事件，死亡人數(shù)高達(dá)64人。AIV作為是否可有引起人類(lèi)流感大暴發(fā)及其對(duì)人類(lèi)健康的潛在威脅［2］是值得研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

三、禽流感檢測(cè)技術(shù)

1.病毒的分離鑒定

在無(wú)菌條件下采集病料，常規(guī)處理后接種9～10日齡的雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其血凝活性，若結(jié)果是陰性則繼續(xù)盲傳2～3代。如有血凝活性，則應(yīng)通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)來(lái)確定分離的病毒是禽流感病毒、新城疫病毒還是禽腺病毒，如果抗禽流感的血清能抑制血凝現(xiàn)象的話(huà)，那樣就證明有禽流感病毒存在。病毒分離鑒定法對(duì)禽流感的診斷準(zhǔn)確性高，但操作程序繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，因此在臨床診斷上一般不采取這種方法。

2.免疫學(xué)診斷技術(shù)

（1）瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。其原理是利用可溶性抗原與抗體特異性結(jié)合，在瓊脂中擴(kuò)散形成濃度梯度來(lái)檢測(cè)AIV群特異性血清抗體的一種試驗(yàn)方法。禽流感瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，既可定性又可定量，但總體而言此法在檢測(cè)禽流感抗體水平上的敏感度、準(zhǔn)確度較低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

（2）神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)（NIT）。NIT主要用于禽流感病毒的亞型鑒定，其依據(jù)A型流感病毒的表面抗原特性，特別是神經(jīng)氨酸酶的特性來(lái)鑒定流感病毒。

（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。用酶標(biāo)記抗原或抗體，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)相應(yīng)抗體或抗原的一種方法。本法具有特異、快速、敏感、微量的特點(diǎn)，因此，本法也常用于大批樣品和血清學(xué)檢疫。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所已經(jīng)建立了一系列ELISA方法，如建立了禽流感病毒重組核蛋白ELISA診斷技術(shù)、禽流感間接ELISA診斷試劑盒、禽流感Dot-ELISA方法等。

（4）病毒中和試驗(yàn)。病毒中和試驗(yàn)只有在抗體與病毒粒子上表面抗原相一致，特別是和吸附到宿主細(xì)胞上的病毒一致時(shí)，才能取得滿(mǎn)意結(jié)果。其敏感性、特異性、檢出率相當(dāng)高，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力，由于特異性高，所以很多新的檢測(cè)方法都以這個(gè)方法作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量。

（5）血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)。HA和HI試驗(yàn)是診斷AIV和血清樣品檢疫中最常用的方法之一。由于家禽血清中存在著一些非特異性血凝抑制因子，在HI試驗(yàn)中常會(huì)造成一定數(shù)量的假陽(yáng)性，因此進(jìn)行HI試驗(yàn)前，血清樣品除了需滅活外，還應(yīng)該用高碘酸鈉除去非特異性血凝抑制因子。

3.分子生物學(xué)檢測(cè)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）、核酸探針和熒光PCR技術(shù)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，以禽流感病毒RNA為檢測(cè)目標(biāo)所建立的一種快速檢測(cè)診斷技術(shù)，已成功的應(yīng)用于禽流感病毒的基因檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。我國(guó)最新建立的禽流感病毒熒光RT-PCR診斷試劑盒已獲得新獸藥證書(shū)。除了上述已在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的檢測(cè)方法外，核酸依賴(lài)擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）以及基因芯片等基因診斷技術(shù)也在禽流感檢測(cè)中發(fā)揮作用。

四、結(jié)語(yǔ)

控制禽流感需要采取多方面的措施，包括疫苗接種，嚴(yán)格的生物安全措施以及建立快速、高效、特異性高的診斷方法。盡管各國(guó)科研工作者已經(jīng)建立了多種診斷禽流感病毒的方法，但是目前尚無(wú)一套固定成熟的防治方法。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.3版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010:122-141.

［2］黃京燕，劉宏偉，趙海燕等.禽流感的危害及防控措施［J］.上海訊牧獸醫(yī)通訊，2007（1）:55.