電針對創(chuàng)傷后應激障礙模型大鼠藍斑nNOS表達的影響**

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電針對創(chuàng)傷后應激障礙模型大鼠藍斑nNOS表達的影響**

謝康楠1唐國慶1詹海斌1楊凱1趙健2

皖南醫(yī)學院1臨床醫(yī)學院2011級2人體解剖學教研室，安徽省蕪湖市241002

創(chuàng)傷后應激障礙(Posttraumatic stress disorder, PTSD)，指對親身經歷、目擊的導致或可能導致自己、他人死亡或嚴重軀體傷害的意外事件、嚴重創(chuàng)傷的強烈反應，主要由交感腎上腺髓質系統(tǒng)(SAS)的快速激活和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA axis)的興奮激活來激發(fā)。一氧化氮(Nitricoxide, NO)在生物體各組織中都有廣泛的分布，特別是在神經組織中。研究表明針灸有助于治療PTSD患者[1，2]，邁克爾·霍利菲爾德博士及其同事對73位被診斷為PTSD患者進行分組治療，結果發(fā)現中醫(yī)傳統(tǒng)的針灸治療效果與認知行為治療相似[3]。國內學者采用穴位刺激調控結合藥物[4]、不同針灸方法結合[5]、認知行為療法配合穴位刺激調控法[6，7]及藥物治療配合高頻重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)[8]等方法治療PTSD患者，均取得了肯定的臨床療效。上述研究多集中在電針對PTSD的臨床療效方面，而電針對PTSD治療的機制研究報道較少。本實驗主要觀察低頻電針對PTSD模型大鼠藍斑內神經元型一氧化氮合酶(neural nitric oxide synthase,nNOS)表達的影響，探討電針治療PTSD的可能機制，旨在為臨床應用電針治療PTSD提供一些基礎形態(tài)學依據。

1材料與方法

1.1動物分組與模型建立成年雄性SD大鼠30只，體重200~250g。動物適應性飼養(yǎng)1周后隨即分為三組：正常對照組、模型組和電針組。模型組采用單程長時應激(Single prolonged stress,SPS)方法，步驟如下：禁錮2h；強迫性游水20min后干燥毛發(fā)，休息15min；乙醚麻醉。無干擾空間、常規(guī)喂養(yǎng)1周后對大鼠進行行為學檢測(曠場實驗、拒俘反射、恐懼記憶)，以確定模型成功。電針組在模型建立后給予低頻(2Hz)電針刺激“百會”與“足三里”穴，強度3V，波寬1ms，持續(xù)30min，連續(xù)1周。對照組不予以任何刺激和電針治療。

1.2實驗方法上述實驗步驟完成后，三組大鼠給予戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，經左心室灌注固定，取腦放置于4℃的4%甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋。連續(xù)組織切片，片厚5μm，常規(guī)脫蠟至水，SABC法進行免疫組化染色：3%H2O2孵育5~10min，微波抗原修復(高溫3min，低溫12min)，自然冷卻后滴加5%BSA封閉液室溫孵育20min，滴加一抗4℃過夜。次日于常溫滴加生物素化二抗37℃水浴2h，滴加SABC 37℃水浴30min，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。最后脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3統(tǒng)計學分析利用Olympus顯微鏡及成像系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)對各組大鼠藍斑(圖1)nNOS陽性神經元進行計數并測量平均灰度值，每組10只大鼠共測20個單位面積的灰度值(其中每只隨機測2個單位面積)。數據以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖1　大鼠藍斑區(qū)定位

注：免疫組化染色，×40，冠狀切面前面觀，黑色方框內為鏡下檢測部位。

2結果

2.1行為學結果觀察模型組大鼠5min穿行格數和直立次數顯著低于正常對照組(P<0.01)，電針組大鼠5min穿行格數和直立次數較模型組有所增加(P<0.01)，但仍低于正常對照組。見表1。

表1　各組大鼠行為學觀察結果(±s，n=10)

表1　各組大鼠行為學觀察結果(±s，n=10)

行為正常對照組模型組電針組穿格數97.4±11.3950.9±7.59*72.6±14.95#直立數14.4±2.559.7±2.26*14.1±3.03#

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.2免疫組織化學實驗結果觀察正常對照組大鼠藍斑區(qū)有少量nNOS陽性神經元表達，胞漿著色，胞核呈空泡狀。模型組大鼠藍斑nNOS陽性神經元數量較正常對照組明顯增多(P<0.01)，細胞染色加深，細胞平均灰度值明顯降低(P<0.01)。電針組大鼠藍斑區(qū)nNOS陽性神經元數較模型組明顯減少，細胞染色變淡，平均灰度值有所升高(P<0.01)。 見圖2、3。

正常對照組　　　　　　　　　　　　　　　　模型組　　　　　　　　　　　　　　　電針組

3討論

以往的研究表明，通過單一應激因子制作PTSD動物模型往往很難產生理想的效應。由Porsolt[9]等最先設計了強迫游泳，用來模擬自然情況下在水中的創(chuàng)傷經歷，大鼠會產生溺水的恐怖感，從發(fā)生上接近PTSD的致病病因。隨后Liberzon[10]等進一步改進發(fā)展了單一長時程應激，增加心理應激(束縛)、生理應激(強迫游泳20min后，再以乙醚麻醉致意識喪失)，模擬了大鼠在自然環(huán)境中有可能遭遇到的應激類型，再給予大鼠應激后采用不受打擾的飼養(yǎng)方式，這樣較好的避免了環(huán)境因素對模型的影響，確保模型的穩(wěn)定性，并能誘發(fā)動物表現出PTSD的臨床癥狀和神經內分泌改變[11]，隨后在2005年日本文部省召開的國際PTSD科學會議上，SPS法被確定為公認的PTSD動物模型制作方法[12]。本實驗進一步驗證了SPS法能使大鼠在相對較短時間內的應激下理想地顯示長期的行為學改變。SPS刺激后的大鼠經過7~14d靜養(yǎng)，在活動習性上有明顯改變，焦慮情緒以及恐懼記憶增強，學習能力受損，與PTSD患者臨床癥狀需要幾個月的孕育期，其癥狀開始明朗的特點相似，其表現符合PTSD患者主要的臨床表現。

圖3　各組大鼠藍斑區(qū)nNOS陽性神經元細胞數

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

根據NOS的性質結構及其對鈣的依賴性不同，可分為二大類，即Ca2+依賴性的結構型NOS和非Ca2+依賴性的誘導型NOS，前者又根據存在的部位和分子的大小不同分為nNOS和內皮型NOS，在中樞神經系統(tǒng)中主要是nNOS。nNOS在神經內分泌調節(jié)與行為調控、突觸可塑性與神經再生、神經傳導與神經元發(fā)育等多種中樞神經系統(tǒng)生理功能中起重要的調節(jié)作用[13]。侯良芹[14]等研究發(fā)現，PTSD模型大鼠海馬nNOS表達增強，電針可恢復性下調其表達。PTSD模型大鼠海馬內高表達的NO可能參與了海馬神經元損傷、凋亡導致體積縮小的病理過程。

藍斑位于腦橋背側第四腦室底的界溝上部深面，纖維聯系較為廣泛，其內富含大量的去甲腎上腺(NE)能神經元，并在應激狀態(tài)下被迅速激活，使NE合成增多，從而適應機體內外環(huán)境的變化。李慢[15]對發(fā)生PTSD的退伍軍人進行尸體解剖發(fā)現，藍斑神經元數目減少，并存在神經元細胞凋亡現象。由此可見藍斑的功能變化在PTSD的發(fā)生中有重要作用。本實驗觀察到PTSD模型大鼠藍斑內nNOS的表達增強，這與海馬區(qū)的現象一致，進一步提示NO在應激引起的神經元損傷、凋亡等病理過程中起著重要的調節(jié)作用。

百會位居巔頂，歸屬督脈，督脈“入絡腦”，本著“經脈所過，主治所及”，其對于與腦有關的神經系統(tǒng)疾病有治療作用。朱寅初等[16]研究顯示，電針百會、足三里穴對模型動物記憶力的下降有改善作用。所以，選取督脈腧穴是治療精神神經疾病的重要方法。本實驗結果顯示，電針組大鼠藍斑內nNOS表達較模型組有所減弱，提示電針能下調PTSD模型大鼠nNOS的過高表達，其機制可能與電針能顯著降低應激大鼠異常升高的藍斑NO含量和NOS活性，從而防止藍斑神經細胞丟失有關，確切機理尚有待進一步研究。

參考文獻

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◎致作者◎

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摘要目的：觀察電針對創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)模型大鼠行為學的影響，并進一步研究電針對PTSD模型大鼠藍斑核神經元型一氧化氮合酶(nNOS)表達的影響。方法：將雄性SD大鼠30只隨機分為三組：正常對照組、模型組和電針組，每組10只。采用單程長時應激(SPS)方法建立PTSD模型，模型建立后電針大鼠“百會”穴和“足三里”穴，頻率2Hz，強度3V，持續(xù)30min，連續(xù)1周。采用免疫組織化學方法觀察nNOS在大鼠藍斑的表達。結果：與正常對照組比較，模型組大鼠藍斑nNOS陽性細胞數明顯增加(P<0.01)，平均灰度值顯著降低(P<0.01)；電針后大鼠藍斑nNOS陽性細胞數明顯減少(P<0.01)，平均灰度值顯著增加(P<0.01)。 結論：電針可下調PTSD模型大鼠藍斑nNOS的表達，推測這可能是電針治療PTSD機制之一。

關鍵詞PTSD藍斑神經元型一氧化氮合酶電針大鼠

Effect of Electroacupuncture on Locus nNOS Expression in Rats of Post-traumatic Stress Disorder Model

XIE Kangnan#，TANG Guoqing，ZHAN Haibin，etal.#DepartmentofClinicalMedicine,Classof2011,WannanMedicalCollege,WuhuCity,AnhuiProvince241002

ABSTRACTObjective:To observe the electrical behavior of rats to learn the impact of post-traumatic stress disorder(PTSD),and further study the expression for the electric rat model of PTSD locus coeruleus neuronal nitric oxide synthase (nNOS) impact.Methods:30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: normal control group, model group and electroacupuncture(EA) groups of 10. Using one-way long stress (SPS) method to establish PTSD model after model“Baihui”Point EA rats and“Zusanli”Point, frequency 2Hz,strength 3V,sustained 30min,for a week.Immunohistochemistry was used to observe the expression of nNOS in rat locus coeruleus.Results:Compared with the normal control group,model group locus coeruleus nNOS positive cells was significantly increased (P<0.01),significantly reduce the average gray value(P<0.01);rat locus coeruleus nNOS positive cells was significantly reduced after EA (P<0.01),a significant increase in the mean gray value (P<0.01).Conclusion:EA can down regulate the expression of nNOS locus coeruleus PTSD rat model,suggesting that this may be one mechanism of acupuncture treatment of PTSD.

KEY WORDSPTSD,Locus coeruleus,Neuronal nitric oxide synthase,EA,Rat

收稿日期2015-05-15

中圖分類號：R-33

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)18-2421-03

基金項目：安徽省大學生創(chuàng)新訓練項目(AH201310368127)。通訊作者：趙健