Whirlin與不和actin微絲相偶聯(lián)的espin存在相互作用

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Whirlin與不和actin微絲相偶聯(lián)的espin存在相互作用

王樂1,郝繼龍1,韋博2*,唐麗萍3

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130033；

3.吉林匯鋒眼科醫(yī)院 眼科，吉林 長春130000)

Usher 綜合征是一種以視力下降和聽力漸進(jìn)受損最終耳聾為主的一種綜合征[1-3]。臨床上共分為三種類型，其中Usher 綜合征II型最為常見。視力受損主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞受損后導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性，視野逐漸變小，聽力受損主要表現(xiàn)各種不同程度的聽力喪失。眾所周知，whirlin,espin,vlgr-1這三個蛋白是組成USH2蛋白復(fù)合體的支架蛋白，任何一個蛋白的缺失都會導(dǎo)致USH2疾病的發(fā)生[4-6]。Espin是目前被發(fā)現(xiàn)USH2蛋白復(fù)合體里的一個新成員，并證實與whirlin存在相互作用，但至于whirlin與espin如何相互作用及相互作用的條件仍不是很清楚。

1資料與方法

1.1儀器和試劑細(xì)胞培養(yǎng)6孔板、水浴箱、低溫超速離心機(jī)、-80°冰箱、超聲處理器、電泳儀、倒置熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡。一抗購于Santa Cruz生物技術(shù)公司，蛋白G購于Amersham Biosciences公司。

1.2　實驗方法及步驟

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含有5%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)體外細(xì)胞(COS-7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞)。將細(xì)胞均勻懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中并平鋪培養(yǎng)皿上，24 h后用TurboFect體外轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬間轉(zhuǎn)染，具體如下：用0.4 μg的質(zhì)粒稀釋在25 μl不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液中，混勻后，將轉(zhuǎn)染試劑加入培養(yǎng)基中，再與稀釋的質(zhì)粒培養(yǎng)液混合，室溫放置15 min，然后孵育10 h，至于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2體外細(xì)胞免疫共沉淀和western blotting將有目的蛋白表達(dá)的HEK293細(xì)胞中，加入裂解液并進(jìn)行研磨。離心后將上清液中加入蛋白 G搖晃孵育。離心后取上清液，加入一抗搖晃3.5 h，再離心后取的上清液中加入蛋白 G sepharose,搖晃1.5 h。短暫離心后,洗沉淀物4次，再煮沸10 min。Cytochalasin D處理組，是在細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%后，加入4.5μM cytochalasin D/DMEM/5%FBS培養(yǎng)液中室溫孵育2h。DMSO(1∶500)處理DMEM/5%FBS里的細(xì)胞作為對照組。將所得蛋白進(jìn)行western blotting,過程如下：用SDS-PAGE膠分離目的蛋白，并提純后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。經(jīng)過10%脫脂牛奶封閉蛋白1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗4℃孵育1 h，最終觀察蛋白條帶。

1.2.3熒光染色和共定位分析將細(xì)胞放于-80℃冰箱20 min，用再放入5%山羊血清/(Goat Serum,GS)PBS孵育2 h,一抗4℃孵育過夜，用PBS洗10 min，共6次。加入相應(yīng)二抗/5%GS/ PBS均勻搖晃1 h。共聚焦顯微鏡下觀察并截取目的區(qū)域。

2結(jié)果

2.1Whirlin與不和actin偶聯(lián)的espin相作用在GFP-actin和espin共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞里，espin和actin微絲共定位，espin與肌動蛋白束偶聯(lián)在一起，說明espin的纖維結(jié)構(gòu)是肌動蛋白束,(圖1)。在espin、actin和whirlin共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞里,espin的纖維結(jié)構(gòu)仍與actin共定位，但在這些espin/actin微絲里，whirlin表現(xiàn)出不強(qiáng)的信號(圖2)。表明當(dāng)espin和actin微絲結(jié)合成束時，whirlin不能與espin有相互作用。眾所周知，Cytochalasin D是能夠結(jié)合肌動蛋白微絲，但是同時又抑制肌動蛋白聚合成束的一種藥物[7]。最新的研究表明，它對肌動蛋白微絲的拆卸和聚合非常有效。我們把cytochalasin D加入細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)肌動蛋白束被大量破壞，間接釋放了大量espin蛋白。從我們實驗的結(jié)果中看，用GFP標(biāo)記espin的蛋白量在免疫沉淀物中增加了4倍。(比較圖3上面和圖3下面)。這個結(jié)果與體外細(xì)胞共定位的結(jié)果一致(圖1和圖2)。從而證實當(dāng)espin與actin微絲不結(jié)合成束的時候，whirlin和espin存在相互作用。

圖1在GFP-actin和espin共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，espin和肌動蛋白微絲共定位

圖2　在whirlin,actin和espin共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，whirlin與espin/肌動蛋白微絲極少共定位

2.2　whirlin與actin無相互作用

既然whirlin和espin存在相互作用，而espin又和actin微絲相偶聯(lián)，那么，whirlin與actin之間有直接作用嗎？在whirlin和espin共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞里，從免疫共沉淀的結(jié)果看，whirlin抗體能沉淀下來espin。但是無論我們用Cytochalasin D處理還是不用Cytochalasin D處理細(xì)胞，始終沒有發(fā)現(xiàn)whirlin和actin之間有相互作用(圖4)。

在whirlin和GFP-espin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞里，未經(jīng)過Cytochalasin D處理的對照組(圖3上面)和經(jīng)過Cytochalasin D處理的治療組(圖3下面)相比,espin蛋白強(qiáng)度顯著增加。圖3　經(jīng)過Cytochalasin D處理，whirlin與espin之間　的蛋白相互作用強(qiáng)度顯著增加

圖4　在GFP標(biāo)記espin 轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞里，actin　和GFP-espin相互作用

3討論

我們用一系列實驗證實了whirlin和espin之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)他們之間相互作用是很微弱。而Espin和actin微絲/單體又是非常高的親和力[8]。從實驗結(jié)果來看，用cytochalasin D處理過的細(xì)胞，大約也只有1-1.5%的GFP-espin蛋白存在whirlin沉淀物中(圖3)，這個微弱的相互作用主要是因為whirlin只與不和actin微絲偶聯(lián)的espin相互作用(圖2，圖3)。最終，在espin蛋白與actin蛋白中，二者不結(jié)合的蛋白非常少(這里主要指actin單體)，而在這些少量的蛋白才和whirlin蛋白存在相互親和力，導(dǎo)致whirlin和espin這種弱的相互作用。

參考文獻(xiàn)：

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[8]Sekerkova G,Zheng L,Loomis PA,et al.Espins and the actin cytoskeleton of hair cell stereocilia and sensory cell microvilli.[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(19):2329.

(收稿日期：2015-04-10)

文章編號：1007-4287(2015)07-1052-03

*通訊作者

基金項目：國家自然青年科學(xué)基金項目(81400404)；吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20140520034JH)；吉林大學(xué)白求恩青年科研基金項目(2013205030)