大鼠彌漫性軸索損傷后Nogo-A在腦組織中表達(dá)的 分布與動態(tài)變化及其意義

趙 修，宋錦寧，郗 磊，隋 龍，王文博，劉曉斌

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710038)

◇專題研究◇

大鼠彌漫性軸索損傷后Nogo-A在腦組織中表達(dá)的 分布與動態(tài)變化及其意義

趙 修1,2，宋錦寧1，郗 磊1，隋 龍1，王文博1，劉曉斌1

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710038)

目的 研究Nogo-A在彌漫性軸索損傷(DAI)大鼠腦組織中表達(dá)的分布與動態(tài)變化，探討其在DAI后軸突再生中的作用及意義。方法 SPF級雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常對照組及DAI后2 h組、6 h組、12 h組、24 h組、72 h 組、7 d組，每組6只。應(yīng)用大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制作大鼠DAI動物模型。傷后不同時間點(diǎn)行病理切片HE染色及Nogo-A免疫組織化學(xué)染色。按大腦皮層、大腦白質(zhì)、海馬、胼胝體及腦干5個腦區(qū)，分析Nogo-A的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果 DAI后各觀測腦區(qū)神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞中均可見明顯的Nogo-A表達(dá)，其中以神經(jīng)元表達(dá)為著，Nogo-A表達(dá)變化的時間規(guī)律為：2 h即已明顯升高(P<0.05)，12 h達(dá)高峰，至7 d時，各腦區(qū)Nogo-A表達(dá)已有明顯下降，但仍高于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論 DAI后腦組織Nogo-A表達(dá)的分布與動態(tài)變化與DAI病理變化趨勢基本一致。此種變化規(guī)律可能為傷后神經(jīng)再生過程中在某種信號調(diào)節(jié)機(jī)制下的一種調(diào)適性表達(dá)變化，其可能為新生軸突延伸導(dǎo)向以及介導(dǎo)建立突觸聯(lián)系。

彌漫性軸索損傷；Nogo-A；中樞神經(jīng)損傷；軸突再生；顱腦損傷

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)病情復(fù)雜，其病理機(jī)制目前尚不十分清楚。近年來Nogo-A-NgR系統(tǒng)在腦損傷中作用機(jī)制的研究越來越受到重視。既往研究認(rèn)為Nogo-A作為配體，主要表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞表面，在神經(jīng)發(fā)育及病理?xiàng)l件下，與表達(dá)于神經(jīng)元表面的受體NgR結(jié)合[1-2]。進(jìn)而，通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)軸突生長錐潰變，起到抑制神經(jīng)軸突生長延伸的生物學(xué)作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A在神經(jīng)元內(nèi)也高度表達(dá)，除抑制軸突生長外，尚有多種不同的生物學(xué)功能[3-5]。而對于Nogo-A-NgR系統(tǒng)如何參與DAI的病理過程卻了解甚少。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠DAI后Nogo-A表達(dá)的分布與隨時間動態(tài)變化的規(guī)律，初步探討Nogo-A在DAI發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)，Nogo-A Rabbit polyclonal IgG(Santa Cruz Biotechnology)，UltraSensitive SP超敏試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。圖像采集與分析系統(tǒng)(德國LEICA公司Leica-Q550CW)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 實(shí)驗(yàn)用SPF級SD大鼠42只，雄性，體質(zhì)量256～300 g(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)。飼養(yǎng)條件：6只/籠，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫維持25 ℃左右，12 h光照/黑暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組及DAI后2 h組、6 h組、12 h組、24 h組、72 h組、7 d 組，每組各6只。制作模型過程中死亡或未達(dá)到病理診斷DAI標(biāo)準(zhǔn)的大鼠剔除并補(bǔ)做。本實(shí)驗(yàn)動物倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 DAI模型制作 采用劉曉斌等[6]的方法制作大鼠DAI模型：致傷大鼠給予腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.2 mL/100 g)麻醉，麻醉生效后將大鼠俯臥于20 cm厚的海綿床上，其頭顱經(jīng)頭夾、門齒孔及耳棒呈水平位固定在致傷裝置上，使其與軀干成30°角俯臥于實(shí)驗(yàn)臺面。待其清醒后于掙扎間歇期按下扳機(jī)釋放彈簧，使大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°致傷，如此重復(fù)打擊8次；正常對照組僅給予麻醉。模型建成后，觀察動物的臨床表現(xiàn)并進(jìn)行行為學(xué)評分，正常對照組在清醒后即進(jìn)行。

1.4 動物行為學(xué)觀察 在建立DAI模型后5～10 min，參照MARMAROU[7]的方法及評分標(biāo)準(zhǔn)對致傷后大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分。

1.5 標(biāo)本取材及組織切片制備 各組大鼠于傷后規(guī)定時間點(diǎn)取材，100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，40 g/L多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定。開顱，完整剝離腦干及大腦，留取要研究的腦組織皮層、白質(zhì)、海馬、胼胝體及腦干，放入40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h。行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度均為5 μm，各組標(biāo)本大腦均行冠狀切，腦干行矢狀切，參考包新民等[8]的定位方法，大腦切片取約前囟后4.0 mm前后層面，腦干切片取0點(diǎn)左右切面。每部位留取2張，分別用于HE染色和Nogo-A免疫組化染色。

1.6 HE染色 采用人工操作HE染色方法，蘇木精染色5 min。常規(guī)脫蠟、染色、脫水、透明等操作后封片，置于光鏡下觀察病理改變。

1.7 Nogo-A兔抗大鼠多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟。微波修復(fù)抗原，按免疫組化試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作，Nogo-A兔抗大鼠多克隆抗體工作液稀釋比為1∶200。DAB顯色，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察、拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.8 圖像分析 采用Lerca DMRE圖像采集與分析系統(tǒng)，因Nogo-A陽性染色結(jié)果分布廣泛，既有神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞，又有神經(jīng)纖維髓鞘染色，因此對所染切片采取灰度分析?？贵w的標(biāo)記強(qiáng)度用平均灰度值(A值)表示。用A值進(jìn)行計(jì)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠DAI后的行為學(xué)表現(xiàn) 大鼠致傷后均存活良好。均表現(xiàn)為不同程度的原發(fā)昏迷，表現(xiàn)為翻正反射較正常組稍慢或消失，刺痛反射減弱或消失，瞳孔對光反射遲鈍或消失，持續(xù)約1 min～2 h。2只大鼠出現(xiàn)尿失禁。原發(fā)昏迷清醒后反應(yīng)性、活動能力及平衡能力均有不同程度的下降，持續(xù)約15 min～2 h。正常對照組大鼠麻醉清醒后生命體征正常，活動自如，反應(yīng)敏捷，逃跑迅速。行為學(xué)評分結(jié)果顯示損傷組較正常對照組評分低(P<0.05，表1)。

表1 各組行為學(xué)評分結(jié)果

組別n行為學(xué)評分正常對照組613.00±2.19DAI后2h組67.67±3.88*DAI后6h組65.83±3.87*DAI后12h組66.17±2.79*DAI后24h組66.83±0.41*DAI后72h組66.55±2.63*DAI后7d組68.64±1.32*

與正常對照組比較，*P<0.05。

2.2 大體標(biāo)本 各組實(shí)驗(yàn)動物均未見蛛網(wǎng)膜下腔出血，損傷大鼠肉眼觀未見明顯腦水腫，未見局部腦挫裂傷及血腫。

2.3 HE染色結(jié)果 大鼠DAI后30 min大腦皮質(zhì)(額頂區(qū)，嗅皮質(zhì))、橋延(腹側(cè)，小腦腳)等出現(xiàn)少量神經(jīng)元細(xì)胞胞核固縮，胞質(zhì)深染，腦血管無明顯改變；DAI后6 h組在以上各區(qū)域出現(xiàn)較多神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染、核仁不清，部分軸突腫脹并呈現(xiàn)波浪狀，同時伴有明顯的細(xì)胞周間隙。腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)較多血管周間隙；12 h以上變化有所加重；24 h 腦皮質(zhì)及橋延腦神經(jīng)元細(xì)胞核固縮稍減輕，但是仍伴隨著細(xì)胞周間隙，血管周間隙不明顯。到第7天腦額頂區(qū)及橋延腦區(qū)域存在少量神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞周間隙及血管周間隙均不明顯，膠質(zhì)細(xì)胞增生不明顯。

2.4 腦組織Nogo-A免疫組化染色結(jié)果 Nogo-A DAB顯色后，陽性染色表現(xiàn)為黃褐色。在正常對照組大鼠腦組織大腦皮層、胼胝體、深部白質(zhì)、海馬及腦干處均可見基礎(chǔ)水平表達(dá)，染色均較淡，呈現(xiàn)稍高于背景的淺棕色。細(xì)胞定位主要表達(dá)于神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起，亦可見少突膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)及神經(jīng)纖維染色，不能區(qū)分髓鞘和軸突，亦可偶見胞核著色。DAI后2 h 各腦區(qū)染色強(qiáng)度即已明顯高于正常對照組，呈現(xiàn)深棕褐色。DAI后12 h組腦組織中Nogo-A的陽性表達(dá)較正常對照組明顯增多。神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)纖維均呈現(xiàn)深棕褐色的強(qiáng)陽性著色，尤以神經(jīng)元胞質(zhì)著色為著。尤其以白質(zhì)、海馬及腦干為著。陽性部位位于胞膜、胞質(zhì)，亦可見胞核著色，神經(jīng)纖維著色光鏡下不能分辨軸突和髓鞘(圖1)。

2.5 腦組織Nogo-A免疫組化染色結(jié)果灰度分析 DAI后各組所有觀察區(qū)域Nogo-A表達(dá)與正常對照組比較均有不同程度升高，DAI后2 h即可觀察到表達(dá)明顯升高(P<0.05)。其中胼胝體、海馬、白質(zhì)及腦干升高更為明顯，且程度相近。相比較而言，2 h時皮層升高程度低于其他區(qū)域，但與正常對照組比較P值仍小于0.05。6 h時Nogo-A表達(dá)繼續(xù)升高至接近峰值，至12 h達(dá)到高峰，之后胼胝體、海馬、白質(zhì)及腦干持續(xù)至72 h，表達(dá)僅略有下降。其中海馬、白質(zhì)及腦干區(qū)域6、12、24 h及72 h Nogo-A表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胼胝體區(qū)6 h、12 h及24 h Nogo-A表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h Nogo-A表達(dá)僅與12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與6 h及24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。皮層Nogo-A表達(dá)至72 h已有顯著下降，6 h、12 h及24 h Nogo-A表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h Nogo-A表達(dá)與6 h、12 h及24 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至 7 d 時，各時間點(diǎn)Nogo-A表達(dá)已有明顯下降，但仍高于正常對照組。其中，胼胝體、海馬及白質(zhì)略低于DAI后2 h組(P<0.05)，皮層略高于DAI后2 h組(P<0.05)，而腦干DAI后7 d組與DAI后2 h組Nogo-A表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、表2)。

表2 各組腦組織Nogo-A免疫組化染色結(jié)果灰度值檢測結(jié)果

組別n皮質(zhì)胼胝體海馬白質(zhì)腦干正常對照組6140.41±2.41△139.68±2.08△140.51±3.51△139.63±5.34△141.41±6.10△DAI后2h組6143.69±6.98*△150.60±5.08*△150.38±3.70*△152.57±4.05*△151.63±8.44*△DAI后6h組6163.67±3.80*#163.20±3.60*#160.57±6.36*#160.89±6.75*#158.66±2.89*#DAI后12h組6164.69±4.90*164.05±5.12*162.66±2.12*162.60±3.61*160.22±6.07*DAI后24h組6163.46±3.91*163.85±4.76*161.40±4.19*161.06±3.43*159.61±7.00*DAI后72h組6159.53±2.63*#△161.95±3.82*△159.96±3.31*△160.20±5.82*159.90±7.11*DAI后7d組6146.79±5.32*#△148.55±4.71*#△146.13±4.90*#△147.97±4.59*#△153.99±4.05*#△

與正常對照組比較，*P<0.05；數(shù)據(jù)與表中上方數(shù)據(jù)，即前一時間組別數(shù)據(jù)比較，#P<0.05；與12 h組比較，△P<0.05。

圖1 不同腦區(qū)各時段Nogo-A免疫組化染色切片

Fig.1 Immunohistochemical staining of Nogo-A in different brain regions at each time point (×400)

3 討 論

既往研究認(rèn)為，Nogo-A的生物學(xué)作用在于防止軸突過度芽生以維持正常的中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[1-2]。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)發(fā)育階段，Nogo-A-NgR系統(tǒng)尚存在幫助建立穩(wěn)定的髓鞘通道，引導(dǎo)軸突向著正確的方向延伸以及介導(dǎo)神經(jīng)元之間建立聯(lián)系，形成突觸等作用[3-5]。WANG等[4]檢測出發(fā)育期小鼠前腦Nogo-A呈網(wǎng)絡(luò)狀大量表達(dá)于神經(jīng)元，而成熟小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞表面Nogo-A染色明顯，將發(fā)育階段的腦與成熟個體進(jìn)行比較，則發(fā)現(xiàn)發(fā)育階段的腦幾乎不表達(dá)NgR，此即Nogo-A與NgR在發(fā)育過程中表現(xiàn)出的獨(dú)特的補(bǔ)充表達(dá)和守恒模式[9]，這表明早期Nogo-A作用可能與網(wǎng)狀蛋白功能相關(guān)，而并不與NgR作用。

DAI后必然伴隨著神經(jīng)元及軸突的再生修復(fù)過程，本研究觀測到Nogo-A在傷后明顯升高。Nogo-A是一類多功能信號分子，可能隨其表達(dá)部位的不同而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察到DAI后Nogo-A表達(dá)主要位于神經(jīng)元及軸突，而非少突膠質(zhì)細(xì)胞及其髓鞘。HUBER等[10]認(rèn)為Nogo-A作為神經(jīng)元表面的信號分子時，具有排斥、吸引其他神經(jīng)元、軸突和非神經(jīng)細(xì)胞的功能，很可能在神經(jīng)元-神經(jīng)元、神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞交互作用中起到重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各腦區(qū)Nogo-A表達(dá)與DAI病理損傷的時間演變基本同步。這可能是DAI后機(jī)體將某種損傷信號傳遞至細(xì)胞胞體，進(jìn)而調(diào)控Nogo-A的表達(dá)上調(diào)。在DAI后，神經(jīng)元中大量表達(dá)的Nogo-A的作用可能與發(fā)育階段相類似，可能與網(wǎng)狀蛋白功能相關(guān)，在于介導(dǎo)神經(jīng)元間直接相互作用及建立突觸連接，引導(dǎo)軸突向著正確的方向延伸。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各腦區(qū)Nogo-A表達(dá)強(qiáng)度至遲在傷后72 h即已開始下降，至7 d時達(dá)到2 h水平。目前，關(guān)于Nogo-A表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究尚十分模糊，且在脊髓損傷、腦缺血缺氧性損傷及腦挫傷等不同類型的腦損傷中Nogo-A的表達(dá)曲線形態(tài)各異[11-13]。如前所述，NgR亦可能參與了Nogo-A的表達(dá)調(diào)控，而在脊髓損傷以后，Nogo-A的表達(dá)上調(diào)至中等程度，而NgR的表達(dá)水平仍然維持不變[12]。沈劍虹等[14]研究大鼠DAI后腦內(nèi)NgR表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，傷后24 h的NgR表達(dá)輕度下降；第72 h時軸索的NgR表達(dá)則顯著下降(P<0.05)；到傷后第7天，軸索的NgR表達(dá)水平基本恢復(fù)。DAI后NgR表達(dá)出現(xiàn)迅速下降的可能機(jī)制為Nogo-A與NgR補(bǔ)充表達(dá)和守恒模式的再現(xiàn)有關(guān)。在DAI急性期，損傷因素可能通過某種機(jī)制使少突膠質(zhì)細(xì)胞Nogo-A伴隨神經(jīng)元Nogo-A共同表達(dá)升高。隨之機(jī)體啟動神經(jīng)再生修復(fù)機(jī)制，包括神經(jīng)元大量表達(dá)Nogo-A而NgR表達(dá)下調(diào)等。短暫下調(diào)后繼而升高水平的NgR表達(dá)隨即抑制了神經(jīng)組織(尤其是少突膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)Nogo-A，并使之維持在一個合適的水平，以利于修復(fù)。

本組皮層Nogo-A的表達(dá)表現(xiàn)為升高相對延遲，平臺期與其他區(qū)域基本相近，下降相對提前。分析其原因，可能由于皮層系神經(jīng)元分布密集的區(qū)域，在DAI中，該區(qū)域并非損傷敏感區(qū)域，故不如其他神經(jīng)纖維及少突膠質(zhì)細(xì)胞分布密集區(qū)域反應(yīng)迅速。但一方面，皮髓交界區(qū)亦是DAI易損區(qū)之一，另一方面，遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維的損傷必然會在神經(jīng)元胞體引發(fā)相應(yīng)病理生理變化，故皮層Nogo-A表達(dá)隨后也于6 h迅速達(dá)到平臺。之后72 h時即已開始下降，明顯早于其他區(qū)域，這可能是損傷早期神經(jīng)元合成的大量Nogo-A 迅速順軸漿流轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)端所致。而在單純性DAI中，皮層相對完好，故并不出現(xiàn)早期Nogo-A的表達(dá)下降，反而在遠(yuǎn)端軸突損傷的病理生理改變的刺激下，神經(jīng)元大量合成Nogo-A并向遠(yuǎn)端軸突輸送，導(dǎo)致皮層Nogo-A表達(dá)先升高后迅速下降。

盡管DAI后神經(jīng)元Nogo-A表達(dá)明顯上調(diào)，然而，成熟個體神經(jīng)元及軸突大量表達(dá)的NgR仍可與少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘膜表達(dá)的Nogo-A及其他髓鞘相關(guān)抑制因子結(jié)合。另一方面，在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，僅少部分Nogo-A被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，其余大部分則是和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體相關(guān)聯(lián)[15]。結(jié)合本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為：DAI損傷后，表達(dá)于神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞的Nogo-A-NgR系統(tǒng)在某種信號調(diào)節(jié)機(jī)制下出現(xiàn)調(diào)適性表達(dá)變化，其結(jié)果可能為新生軸突延伸導(dǎo)向以及介導(dǎo)建立突觸聯(lián)系的作用。其具體調(diào)適機(jī)制尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究揭示。

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(編輯 國 榮)

Expression changes of Nogo-A and its significance in rat brain with diffusive axonal injury

ZHAO Xiu1,2, SONG Jin-ning1, XI Lei1, SUI Long1, WANG Wen-bo1, LIU Xiao-bin1

(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China)

Objective To investigate the expression changes of Nogo-A in rat brain with diffuse axonal injury (DAI) and discuss the significance and mechanisms of Nogo-A in axon regeneration after DAI. Methods We divided 42 male SD rats of SPF grade into 7 groups randomly: the control group, DAI 2 h group, DAI 6 h group, DAI 12 h group, DAI 24 h group, DAI 72 h group and DAI 7 d group, with 6 rats in each. The DAI animal models were established using the rat head coronal plane moment rotation acceleration vulnerant equipment. Then HE staining and immunohistochemical staining were used respectively at several time intervals after DAI. Image collection and gradation analysis were carried out in 5 encephalic regions to analyze the changes of Nogo-A expression: the cortex, white matter, hippocampus, corpus callosum and brain stem. Results Nogo-A was expressed significantly in the neurons in all the five encephalic regions and in a small number of oligodendroglia cells, especially in the former. The expression of Nogo-A protein increased obviously 2 hours after DAI (P<0.05), and reached the highest level at 12 h, and had a gradual recovery to the 2-h level by day 7. Conclusion After DAI, Nogo-A expression increased obviously and had dynamic changes, the tendency of which is the same as the pathological change of DAI. After DAI the high expression of Nogo-A in the neurons may be related to the development stage. Nogo-A may play an important role in the process of neural repair.

diffusive axonal injury (DAI); Nogo-A; central nerve injury; axon regeneration; traumatic brain injury

2014-04-21

2014-06-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30471774)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧. E-mail: jinnings@126.com

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201501014

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.0850.004.html(2014-11-19)