HPLC法測定枇杷葉中一種橙花叔醇苷的含量

張紅茹，孫 琳

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457)

?

HPLC法測定枇杷葉中一種橙花叔醇苷的含量

張紅茹1,2，孫 琳2

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457)

目的：建立HPLC法測定枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇苷的含量。方法：采用HPLC法測定，色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(29∶71)；體積流量1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm。結果：倍半萜苷在0.009 629～2.006 μg/ml(r=0.999 6)范圍內與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為96.23%。結論：該方法操作簡單，結果準確，專屬性好，可用于枇杷葉的質量控制。

枇杷葉,倍半萜苷,橙花叔醇苷,含量測定,HPLC

枇杷葉Eriobotryaefolium為薔薇科植物枇杷的干燥葉，具有清肺止咳，降逆止嘔的功效，用于治療肺熱咳嗽，氣逆喘急，胃熱嘔逆，煩熱口渴[1]。枇杷葉的化學成分主要有三萜酸類、倍半萜及其苷類、多酚類、黃酮類以及糖苷類，具有抗炎止咳、抗病毒、降血糖和抗腫瘤等藥理活性[2]。

目前報道的枇杷葉含量測定成分以齊墩果酸、熊果酸等三萜酸類多見[3-5]，也有苦杏仁苷、綠原酸、槲皮素和山奈酚等[6-8]?！吨袊幍洹分衅浜繙y定是以熊果酸和齊墩果酸的三萜酸類為質控指標，但此成分在眾多植物如山楂、女貞子、白花蛇舌草中均有存在且含量較高[9]，故其作為質控指標專屬性較低。本文旨在對枇杷葉中橙花叔醇-3-O-{α-1-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}進行HPLC法測定及方法學考查，以建立該倍半萜苷橙花叔醇苷的含量測定方法，因其為枇杷葉的特征成分，在枇杷葉中比上述其他成分更具專屬性，可作為枇杷葉質量控制指標的有效補充，為質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；AL204-IC型萬分之一天平(Mettler公司)；HU10260B型超聲儀(天津恒奧科技有限公司)。

1.2 試藥 枇杷葉藥材(批號Y-1211-0149，Y-1406-0113，140501,購自天津中新藥業(yè)集團股份有限公司藥材分公司)；橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}(實驗室自制，純度≥98%，以下稱為橙花叔醇苷)；乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)；水為純凈水(Millipore純水機制備)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相乙腈-水(29∶71)；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 ml/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙花叔醇苷對照品適量，加甲醇溶解，配制成0.1 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取枇杷葉粉末(批號Y-1211-0149，過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件分析，結果見圖1。

1.橙花叔醇苷

2.4 線性關系考查 分別精密吸取濃度為0.009 628 8、0.032 096、0.080 24、0.160 48、0.401 2、0.802 4和2.006 mg/ml的對照品溶液各10 μl，按照“2.1”項下色譜條件分析，測定峰面積，記錄數據。以峰面積為縱坐標(Y),濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=3 700 000X+20 494(r=0.999 6)，結果表明橙花叔醇苷在0.009 629～2.006 mg/ml濃度范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，按照“2.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測定其色譜峰的峰面積，計算RSD為0.52%，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同批枇杷葉樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18 h進樣10 μl，測定其色譜峰的峰面積，計算RSD為1.10%，說明供試品溶液在0～18 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取同批枇杷葉樣品6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算質量分數的RSD為0.56%，說明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品0.25 g，加入一定量的對照品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述測定方法進行測定，計算回收率，結果平均回收率為96.23%，RSD為1.20%，結果見表1。

表1 橙花叔醇苷加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取3批枇杷葉，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定橙花叔醇苷的含量，測定結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=2)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器進行200～400 nm全譜測定，結果橙花叔醇苷在紫外光譜中只具末端吸收，為減少溶劑及雜質干擾，故選擇210 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 由于甲醇、甲酸和乙酸等溶劑在210 nm附近均有紫外吸收，對本成分的測定會有干擾，故選擇乙腈水作為流動相，通過流動相比例及不同色譜柱的考查，最終確定了基線平穩(wěn)，峰形較好，保留時間適中的流動相系統(tǒng)。

3.3 提取溶劑和方法的選擇 在實驗過程中考查了分別以100%、70%、50%甲醇及水飽和正丁醇超聲提取，結果表明70%、50%甲醇及水飽和正丁醇提取率相當，但70%、50%甲醇提取雜質較多，故選擇水飽和正丁醇作為提取溶劑。又考查了以水飽和正丁醇為溶劑超聲和加熱回流的提取情況，結果表明超聲提取30 min即可提取完全。

枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}是由意大利學者De Tommasi等[10]從枇杷葉中首次分離得到，并證實其有降低血糖的作用[11]。其苷元橙花叔醇也是枇杷葉中揮發(fā)油的主要成分[12]，具有抗菌作用[13]，與枇杷葉已知療效相關，橙花叔醇苷有可能在體內代謝為橙花叔醇，間接發(fā)揮療效，但還需進一步證實。目前枇杷葉含量測定的指標成分多為三萜酸類，但中藥常用水提或水煎煮后服用，使用脂溶性很強的熊果酸等三萜酸類顯然不太合理，本文建立水溶性的橙花叔醇苷含量測定的方法，以橙花叔醇苷作為枇杷葉的質控指標，可以更合理的控制其質量。

1 中國藥典[S]. 一部.2010：190-191

2 陸林博. 枇杷葉的化學成分研究[D]. 南京師范大學,2006：10-12

3 陳龍勝,忻旸,許舒雯. RP-HPLC同時測定枇杷葉中4種三萜酸[J]. 中草藥,2008,39(9):1411-1413

4 蔡雪萍,李振華,華俊磊，等. 一測多評法測定枇杷葉有效部位中6種三萜酸成分的量[J]. 中草藥,2013,44(21):3057-3062

5 Zhang Y, Xue K, Zhou A,etal.Determination of triterpenoic acid isomers in Eriobotryae folium using high performance liquid chromatography on C30 column[J]. Chinese journal of chromatography,2014,32(1):47-51

6 莊永峰. 高效液相色譜法測定枇杷葉中苦杏仁苷含量[J]. 海峽藥學,2002,14(5):64-65

7 張麗賢,周光明,姜蘭芳,等. 非離子表面活性劑萃取-高效液相色譜法測定枇杷葉中的綠原酸、槲皮素和山奈酚[J]. 食品科學,2012,33(6):150-153

8 孟令軍,李超生,孟慶繁,等. 高效液相色譜法測定枇杷葉藥材中綠原酸的含量[A]. 吉林省科學技術協(xié)會.吉林省第六屆生命科學大型學術報告會論文集[C],2008:22-23

9 相延英,楊光. 常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測定[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志,2004,24(5):61-63

10 De Tommasi N,De Simone F,Aquino R,etal.Plant Metabolites.new sesquiterpene glycosides from Eriobotrya japonica[J]. Journal of Natural Products，1990,53(4):810-815

11 De Tommasi N,De Simone F,Cirino G,etal. Hypoglycemic effects of sesquiterpene glycosides and polyhydroxylated triterpenoids of Eriobotrya Japonica[J].Planta Med,1991,57(5)：414

12 郭宇,吳松吉,樸惠善. 枇杷葉的化學成分及藥理活性研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2006,17(6):928-930

13 陶冉,王成章,孔振武. 銀杏葉類脂成分與聚戊烯醇的協(xié)同抑菌作用[J]. 中國實驗方劑學雜志,2013,19(17):203-210

Determination of nerolidol glycosides inEriobotryaefoliumby HPLC

Zhanghongru1,2，Sunlin2

(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193；2.Tianjin Zhongxin Pharmaceuticals R&D Center,Tianjin 300457)

Objective： To establish an HPLC method for determination of a sesquiterpene glycosides-nerolidol glycosides inEriobotryaefolium.Methods： HPLC was applied with the chromatographic condition as follows:The chromatographic column was Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)at 30 ℃;acetonitrile-water(29∶71) as the mobile phase;flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 210 nm.Results： Linear relationships was 0.009 629～2.006 μg(r=0.999 6),the average recovery was 96.23%.Conclusion： The method is convenient,accurate and specific,can be applied to the quality control ofEriobotryaefolium.

Eriobotryaefolium，sesquiterpene glycosides，nerolidol glycosides，quantitative determination，HPLC

2015-03-17

R927.2

A

1006-5687(2015)03-0009-03