苦橙花精油化學(xué)成分分析及其體外活性

董 雪,劉 霞,肖瑞欣,呂鵬飛,公衍玲*

(1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,山東 青島 266042;2.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院,山東 濰坊 262500)

苦橙(Citrus AurantiumL.)是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citr us)常綠小喬木植物,也被稱為酸橙,原產(chǎn)自阿爾及利亞、摩洛哥、突尼斯、西班牙等許多國家[1]。在我國,長江流域以南的湖南、浙江、江蘇、貴州、江西等地均有種植苦橙[2]?？喑鹊娜~、花、果實(shí)等均有不同的用途,被加工后在各個領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[3]?？喑然ň褪峭ㄟ^蒸餾法從花瓣中提取的,主要成分為檸檬烯、芳樟醇等[4]。外觀呈接近透明的淺黃色,香氣濃郁、明快,帶有自然甜鮮的花香、清新的柑橘果香和淡淡的苦味、藥味的百合花香味,價(jià)格較高。柑橘屬類植物被認(rèn)為具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性及預(yù)防癌癥的作用[5-8]。苦橙花精油可以緩解惡心、消化不良、便秘等癥狀,還具有鎮(zhèn)靜和抑制食欲等作用[8-9]?？喑然ň驮诜枷阈袠I(yè)應(yīng)用較廣泛,但關(guān)于其藥理活性的基礎(chǔ)研究較少。

因此,本研究擬分析苦橙花精油的化學(xué)成分并測定其體外活性,以期為苦橙花資源的開發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

苦橙花精油,青島青竺生物科技有限公司。產(chǎn)地摩洛哥,用無菌花生油溶解,分別制成0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－15個不同濃度的苦橙花精油溶液;透明質(zhì)酸酶、酪氨酸酶,合肥博美生物公司;撲爾敏,湖北邁恩生物科技有限公司;熊果苷,成都曼思特生物科技有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、無乳鏈球菌和枯草芽胞桿菌,青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院;ELISA試劑盒,南京建成生物工程研究所;RA W 264.7巨噬細(xì)胞,上海富衡生物科技有限公司;脂多糖(LPS),碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;酶標(biāo)檢測儀,TECANInfinite 200型,濟(jì)南友澤仁信貿(mào)易有限公司;超凈臺,VS-1300L-U型,蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司;紫外分光光度計(jì),UV-1801型,北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司;立式壓力蒸汽滅菌器,YXQ-LS-SII型,上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;全溫振蕩器,HZQ-Q型,金壇精達(dá)儀器制造廠;氣質(zhì)聯(lián)用儀,7890B/7000C型,美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC-MS分析苦橙花精油的化學(xué)成分

色譜條件:色譜柱是HP-5,載氣為高純氦氣,進(jìn)樣口溫度為280℃,色譜柱初始溫度為50℃(程度升溫)保持2 min,以每分鐘10℃持續(xù)升至280℃,保持10 min,柱壓為10 psi,分流進(jìn)樣,分流比為20∶1,進(jìn)樣量為1μL。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊離子源,電子能量為70 e V,接口溫度為250℃,質(zhì)量掃描范圍為50～600,掃描間歇為1.0 s。所得圖譜采用儀器自帶的NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)自動檢索,同時結(jié)合智能化工搜索引擎,進(jìn)行精油組分定性,各組分含量由色譜峰面積用歸一化法計(jì)算得到。

1.2.2 苦橙花精油的透明質(zhì)酸酶抑制率測定

采用改良版的Morgan-Elson方法[10]檢測苦橙花精油對透明質(zhì)酸酶的抑制率。配制5 mg·mL－1的透明質(zhì)酸原液,4℃保存。將50μL透明質(zhì)酸原液和100μL緩沖液添加到250μL水中。將含有0.2 mol·L－1甲酸鈉、0.1 mol·L－1NaCl和0.2 mg·mL－1牛血清白蛋白(BSA)的緩沖液用甲酸調(diào)節(jié)至合適的p H(2.0～5.0)。將混合物在37℃下孵育10 min,然后加入50μL透明質(zhì)酸酶和100μL不同濃度的苦橙花精油進(jìn)行反應(yīng)。加入110μL的堿性硼酸鹽溶液,在沸水浴中加熱4.5 min,終止酶促反應(yīng)。將17.3 g H3BO3和7.8 g KOH溶解在100 mL水中制成硼酸鹽溶液。向10 mL的堿性溶液中加入1 mL濃度為0.8 g·mL－1的K2CO3溶液。然后將試管置于冰水中20 min,之后加入1.5 mL的對二甲基氨基苯甲醛溶液(將20 g對二甲氨基苯甲醛溶于25 mL濃鹽酸和75 mL冰醋酸的混合物中,制備該試劑,用前以400 mL冰醋酸稀釋)。為了使反應(yīng)混合物顯色最大化,將試管在37℃下孵育20 min。用離心機(jī)在4℃、6 000 r·min－1下處理10 min后,取上清液測吸光度。撲爾敏為本次實(shí)驗(yàn)的陽性對照藥物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次,計(jì)算平均值。透明質(zhì)酸酶抑制率y(%)計(jì)算見式(1)。

上式中:A是對照組溶液的吸光度(將苦橙花精油替換為醋酸緩沖液);B為對照組的空白溶液的吸光度(將透明質(zhì)酸酶溶液/苦橙花精油替換為醋酸緩沖液);C為苦橙花精油組的吸光度;D為苦橙花精油空白溶液的吸光度(將透明質(zhì)酸酶溶液替換為醋酸緩沖液)。

1.2.3 苦橙花精油的酪氨酸酶抑制率測定

根據(jù)文獻(xiàn)中的方法測定酪氨酸酶活性[11-12]。將50μL的苦橙花精油在25℃下孵育10 min后,然后在96孔板中加入50μL濃度為135 U·mL－1的酪氨酸酶和50μL、0.03%的L-多巴溶液。在室溫(25℃)下將上述混合物孵育5 min。在475 n m處,用酶標(biāo)儀測定每個孔的吸光度。每次試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。酪氨酸酶抑制率y(%)計(jì)算見式(2)。

其中,A是具有酶,但不具有苦橙花精油的吸光度;B是不具有苦橙花精油或酶的吸光度;C是具有酶和苦橙花精油的吸光度;D是具有苦橙花精油,但不具有酶的吸光度。

1.2.4 苦橙花精油的體外抑菌活性測定

苦橙花精油的體外抑菌活性是采用抑菌圈方法測定的。將培養(yǎng)好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌菌懸液倒入盛有固體培養(yǎng)基的錐形瓶中,充分震蕩混勻,迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中,放冷,待培養(yǎng)基凝固后打孔,分別加入不同濃度的苦橙花精油和溶劑各20μL,然后放置在37℃的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后觀察并記錄所有抑菌圈的大小。每組實(shí)驗(yàn)平行3次,計(jì)算平均值。

1.2.5 苦橙花精油的體外抗炎活性測定

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RA W264.7細(xì)胞采用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,同時添加1%的青鏈霉素,培養(yǎng)于37℃、5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

1.2.5.2 MTT法檢測苦橙花精油的細(xì)胞毒性

細(xì)胞分為6組,分別為空白組、苦橙花精油(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1)組,每組設(shè)置3個復(fù)孔。取96孔板,向每個孔中加入100μL細(xì)胞懸液(1×105個·mL－1),然后分別吸取100 μL的DMEM完全培養(yǎng)基加到每個孔中,將孔板平放于于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入0.5 mg·mL－1的MTT溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。分別在每孔中加入150μL DMSO,使結(jié)晶物充分溶解,在490 n m處,用酶標(biāo)儀檢測并記錄吸光度A,根據(jù)吸光度A來判斷不同濃度的苦橙花精油對細(xì)胞活性的影響。細(xì)胞存活率x(%)計(jì)算公式見式(3)。

式中:A0為空白組的吸光度;A1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度;A2為對照組的吸光度。

1.2.5.3 ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-β、IL-6、TNF-α的表達(dá)

將RA W264.7細(xì)胞(1×105個·mL－1)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。分為7個組,即空白組(加DMEM培養(yǎng)基)、炎癥模型組和5個給藥組。模型組和給藥組均用LPS(1μg·mL－1)誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥。給藥組分別加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油,空白組和模型組分別給與等體積的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。經(jīng)消化、離心后,取細(xì)胞上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明操作,測定細(xì)胞上清液中促炎細(xì)胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦橙花精油的GC-MS分析結(jié)果

苦橙花精油的GC-MS總離子圖見圖1?？喑然ň蜋z測的主要成分分析見表1?？喑然ň椭泄矙z測出36種化合物,其主要的化合物類別為醇類、萜烯類和酯類化合物,含量分別為49.77%、22.93%和24.22%。其中芳樟醇的含量占比最高,為24.72%,因此,芳樟醇是苦橙花精油的主要成分。其次,苦橙花精油中的相對含量較高的酯類化合物(乙酸芳樟酯),為11.56%,萜烯類化合物中檜烯含量最高,為7.01%。酚類、醛類和酮類化合物相對較少,分別為1種、2種和1種?？喑然ň统煞謴?fù)雜,推測其藥理活性較廣泛,同時也在一定程度上限制了對其的進(jìn)一步開發(fā)利用。

圖1 苦橙花精油的GC-MS總離子圖Fig.1 Total ion diagram of GC-MS of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers

表1 苦橙花精油檢測的主要成分分析Table 1 Analysis of main co mponents of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flowers

2.2 苦橙花精油對透明質(zhì)酸酶的抑制作用

苦橙花精油與撲爾敏濃度對透明質(zhì)酸酶抑制率的影響見圖2。由圖2可見,隨著濃度的變化,苦橙花精油可以不同程度地抑制透明質(zhì)酸酶的活性。在0.5 mg·mL－1到2.0 mg·mL－1濃度范圍內(nèi),苦橙花精油對透明質(zhì)酸酶的抑制作用呈劑量依賴性。在2.0 mg·mL－1時,苦橙花精油對透明質(zhì)酸酶的抑制率達(dá)到最大值,在2.5 mg·mL－1時抑制率不再升高,趨于平緩,機(jī)理有待進(jìn)一步研究。在本研究中,苦橙花精油顯示出一定的抑制透明質(zhì)酸酶活性,雖然活性低于同劑量的撲爾敏,但其來源于天然植物,安全范圍大,可能是一種潛在的抗過敏藥物。

圖2 苦橙花精油與撲爾敏濃度對透明質(zhì)酸酶抑制率的影響Fig.2 Hyaluronidase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and clor phena mine maleate

2.3 苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制作用

苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制作用見圖3。在各種美白靶標(biāo)中,酪氨酸酶是黑色素生物合成中的主要酶,它催化從L-酪氨酸到3,4-二羥基苯基-L-丙氨酸(L-DOPA)和從L-DOPA到多巴醌的氧化反應(yīng)。多巴醌通過氧化聚合產(chǎn)生黑色素。因此,具有酪氨酸酶并顯示出氧化抑制作用的試劑將是皮膚美白治療的合適靶標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),苦橙花精油可不同程度地抑制酪氨酸酶活性,從而抑制黑色素的形成,且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。同時還發(fā)現(xiàn),苦橙花精油對酪氨酸酶的抑制活性略優(yōu)于同等劑量的熊果苷,而熊果苷作為美白劑在化妝品中廣泛應(yīng)用。因此,苦橙花精油作為新型美白成分值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

圖3 苦橙花精油和熊果苷濃度對酪氨酸酶抑制率的影響Fig.3 Tyr osinase inhibition rate of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers and ar butin

2.4 苦橙花精油的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

苦橙花精油具有清新、獨(dú)特的香味,同時也具有多種活性,如抑菌和消炎等。本研究檢測了苦橙花精油的體外抑菌活性,結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度的苦橙花精油對5種細(xì)菌的抑制效果圖Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of essential oil fro m Citr us aur antiu m L.flo wers on five kinds of bacteria

由圖4可以看出,苦橙花精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。在革蘭氏陽性菌中,苦橙花精油對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng),對大腸桿菌的抑制作用較弱。HSOUNA等[14]也報(bào)道了類似的結(jié)果,他們報(bào)道苦橙花精油對所有檢測到的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌均有抗菌活性。結(jié)果表明,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌相比,前者對苦橙花精油更為敏感。這些差異可以部分歸因于革蘭氏陰性菌的雙膜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比革蘭氏陽性菌的單膜結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中親水性多糖鏈的存在已被證明有助于抵抗疏水性植物油。

2.5 苦橙花精油對細(xì)胞活性的影響

圖5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)濃度為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL－1的苦橙花精油處理的RA W264.7細(xì)胞與空白對照組的RA W264.7細(xì)胞相比,細(xì)胞活性沒有顯著差異,說明苦橙花精油對RA W264.7細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性。

圖5 苦橙花精油濃度對RA W264.7細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effect of essential oil from Citr us aurantium L.flowers on the activity of RAW264.7 cells

2.6 苦橙花精油對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎性因子的影響

RA W264.7是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞系,常用于建立炎癥細(xì)胞模型。在本實(shí)驗(yàn)中,使用LPS誘導(dǎo)RA W264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型,通過ELISA試劑盒測定IL-β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量,從細(xì)胞、分子水平探討苦橙花精油的抗炎作用,旨在為苦橙花的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

苦橙花精油對LPS誘導(dǎo)的RA W264.7細(xì)胞分泌IL-β、IL-6、TNF-α的影響見圖6。結(jié)果顯示,與空白組相比,LPS組中IL-β、IL-6、TNF-α水平顯著升高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥。與LPS組比較,5個不同濃度的苦橙花精油均能明顯地抑制由LPS誘導(dǎo)的RA W264.7炎癥細(xì)胞中IL-β、IL-6、TNF-α的升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01),且隨著濃度的增加,其抑制作用加強(qiáng),表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

圖6 苦橙花精油濃度對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響Fig.6 Effect of essential oil fr o m Citr us aur antiu m L.flowers on expression of infla mmator y cytokines in LPS-induced RA W264.7 cells

3 結(jié) 論

通過GC-MS分析,從苦橙花精油中共檢識出36種化合物,其主要的化合物類別為醇類、萜烯類和酯類化合物,含量分別為49.77%、22.93%和24.22%。苦橙花精油能顯著抑制透明質(zhì)酸酶和酪氨酸酶的活性,具有一定的抗過敏活性和較好的美白效果。同時,本研究結(jié)果顯示苦橙花精油具有廣譜抗菌活性,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙雷氏菌和枯草芽胞桿菌這5個菌株均具有一定的抑制作用,同時還能抑制LPS引起的炎癥因子的分子,具有抗炎活性?？喑然ň偷捏w外活性可能與其含有的萜類、醇類等物質(zhì)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為苦橙花精油在天然美白劑、抗過敏以及抑菌抗炎劑的應(yīng)用領(lǐng)域提供了一定了理論依據(jù),考慮可以將其用于日化產(chǎn)品、功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。然而,為闡明苦橙花精油潛在的有效性,還需要對其體內(nèi)效價(jià)和作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。