楊薇,徐梅梅,夏鳳宇,姜東春,劉紅利
(秦皇島市第一醫(yī)院,河北秦皇島066000)
三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)基因在一些腫瘤中參與調控染色質動力活性、基因組轉錄活性和細胞凋亡過程[1~3],其編碼蛋白質具有AAA區(qū)域和溴區(qū)結構域。AAA區(qū)域作為分子伴侶,執(zhí)行裝配、操作、分解蛋白復合物的功能;溴區(qū)結構域參與基因轉錄調控、細胞周期調控、信號轉導,其表達異常導致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展,提示ATAD2極可能為一個腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關基因[4~6]。因此,我們觀察了胃癌組織及癌旁正常組織中的ATAD2表達變化,并探討其意義。
1.1 臨床資料 2005~2009年秦皇島市第一醫(yī)院收集的配對胃癌標本和癌旁組織標本129例,均經病理證實,患者均未經術前放療及化療。其中,男97例、女32例,年齡26~78歲、中位年齡56歲;高分化15例,中分化47例,低分化67例;TNM分期Ⅰ~Ⅱ期44例,Ⅲ~Ⅳ期85例。
1.2 ATAD2 mRNA檢測 采用Real-time PCR法。TRIzol試劑提取癌組織和癌旁組織細胞總RNA,按TRIzol試劑盒說明書進行操作。使用NanoDrop? ND-1000檢測RNA濃度和純度,應用DEPC水將RNA濃度調到500 ng/μL。反轉錄條件:37℃ 15 min,85℃5 s,4℃保存;30 s 95℃,40個循環(huán);5 s 95℃,30 s 62℃。引物序列:ATAD2和β-actin基因的引物設計均購自沈陽立信生物技術有限公司。ATAD2上游引物為5'-GGAATCCCAAACCACTGGACA-3',下游引物為5'-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3';GAPDH上游引物為5'-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3',下游引物為5'-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'。ATAD2 mRNA相對表達以2-ΔΔCT表示,>1.0為高表達,<1.0為低表達。
1.3 ATAD2蛋白檢測 所有標本組織經常規(guī)甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚4μm。高溫抗原修復,PBS沖洗3次,每次5 min。每張切片滴加50μL的鼠抗人ATAD2單克隆抗體一抗,4℃冰箱孵育過夜,PBS沖洗3次,每次5 min;滴加50μL的二抗,室溫孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min;DAB顯色,中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替一抗。光鏡下每張切片選取癌細胞較多的10個高倍視野,計數100個細胞中的陽性細胞數,無陽性細胞為陰性,陽性細胞數≤5%為弱陽性,6%~20%為陽性,>20%為強陽性;其中強陽性和陽性為高表達,弱陽性和陰性為低表達。
1.4 隨訪與資料收集 對患者進行隨訪,截止時間為2011年12月,記錄患者的生存期以及腫瘤浸潤深度、腫瘤部位、分化程度、TNM分型、淋巴結轉移數、腫瘤大小情況。
1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示,組間比較用配對t檢驗。ATAD2 mRNA表達與臨床病理因素的關系采用χ2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法,Log-rank檢驗判斷差異性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 胃癌及癌旁組織ATAD2 mRNA和蛋白表達比較 胃癌組織ATAD2 mRNA相對表達量為7.67± 2.09,癌旁組織為1.00±0.11,P<0.01。胃癌組織ATAD2蛋白定位在細胞核,其中高表達77例、低表達52例,癌旁組織中未見ATAD2蛋白表達。
2.2 ATAD2 mRNA表達與胃癌患者預后的關系隨訪時間1~66個月,中位隨訪時間為36個月;32例失訪,隨訪率75%。胃癌組織ATAD2 mRNA高表達患者生存時間為(22±2)個月,低表達患者為(34±5)個月,P<0.05。
2.3 ATAD2蛋白表達與胃癌患者臨床因素的關系見表1。
表1 ATAD2蛋白表達與胃癌患者臨床因素的關系[例(%)]
ATAD2位于染色體8q24上,是新近發(fā)現的重要轉錄因子,多種人類腫瘤在這個區(qū)域都有異常。它是c-MYC、雄激素受體和ER-a的輔助因子,并受雌雄激素的控制[7,8]。目前,關于ATAD2影響腫瘤細胞增殖及細胞周期的分子機制還不清楚。有研究表明,ATAD2與c-MYC形成共表達復合物,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,對腫瘤增殖起重要的驅動作用[9]。近年來國內外一些研究顯示,ATAD2高表達可能與某些人類實體腫瘤的局部侵潤、轉移及影響染色體的穩(wěn)定性有關;ATAD2蛋白的表達與腫瘤患者的預后有關,是判斷腫瘤患者總生存率的獨立預后指標。在乳腺癌中,ATAD2通過控制B-Myb和EZH2促進細胞的增殖;在結腸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中,ATAD2通過與c-MYC、E2F等轉錄因子的相互作用,增強了腫瘤與增殖、抗凋亡等相關基因的表達[10~15]。在肝癌中,ATAD2基因發(fā)現新的外顯子—外顯子連接復合體,并呈現過表達。
胃癌是人類實體腫瘤的一種,目前對ATAD2和胃癌關系的研究較少。本研究應用免疫組織化學和Real-time PCR法對胃癌及其癌旁組織中ATAD2表達情況進行檢測,結果顯示,胃癌組織ATAD2的表達較高,與在乳腺癌的研究中得到的結果相似[15,16]。上述研究結果提示,ATAD2的高表達可能與胃癌的局部浸潤和淋巴結轉移有關。胃癌的治療原則是以手術為主,輔助化療可以提高胃癌患者的生存率。阻斷ATAD2的表達能否提高胃癌患者的生存率及生活質量,有待進一步研究。
ATAD2高表達與胃癌患者預后不良有關。本研究對129例胃癌患者用Kaplan-Meier生存分析,Log-rank檢驗顯示,ATAD2高表達患者預后較差。并且,ATAD2表達與胃癌腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移數和腫瘤大小有關。提示ATAD2可以作為判斷胃癌預后的獨立指標之一,對胃癌患者預后具有指導意義。血清中ATAD2蛋白檢測尚未研究,檢測血清中ATAD2蛋白有望成為胃癌早期診斷的新方向。
[1]Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China[J].World JGastroenterol,2006,12(1):17-20.
[2]Yamasaki T,Nakazaki Y,Yoshida M,et al.Roles of conserved arginines in ATP-binding domains of AAA+chaperone ClpB from Thermus thermophilus[J].FEBS J,2011,278(13):2395-2403.
[3]Nouet C,Truan G,Mathieu L,et al.Functional analysis of yeast bcs1 mutants highlights the role of Bcs1p-specific amino acids in the AAA domain[J].JMol Biol,2009,388(2):252-261.
[4]Prinjha RK,Witherington J,Lee K.Place your BETs:the therapeutic potential of bromodomains[J].Trends Pharmacol Sci,2012,33(3):146-153.
[5]Haynes SR,Dollard C,Winston F,et al.The bromodomain:a conserved sequence found in human,Drosophila and yeast proteins[J].Nucleic Acids Res,1992,20(10):2603.
[6]Dlakic M,Mushegian A.Prp8,the pivotal protein of the spliceosomal catalytic center,evolved from a retroelement-encoded reverse transcriptase[J].RNA,2011,17(5):799-808.
[7]Zou JX,Guo L,Revenko AS,etal.Androgen-induced coactivator ANCCA mediates specific androgen receptor signaling in prostate cancer[J].Cancer Res,2009,69(8):3339-3346.
[8]Ciro M,Prosperini E,Quarto M,et al.ATAD2 is a novel cofactor for MYC,overexpressed and amplified in aggressive tumors[J].Cancer Res,2009,69(21):8491-8498.
[9]Fouret R,Laffaire J,Hofman P,etal.A comparative and integrative approach identifies ATPase family,AAA domain containing 2 as a likely driver of cell proliferation in lung adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2012,18(20):5606-5616.
[10]Zou JX,Revenko AS,Li LB,et al.ANCCA,an estrogen-regulated AAA+ATPase coactivator for ERalpha,is required for coregulator occupancy and chromatin modification[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2007,104(46):18067-18072.
[11]Revenko AS,Kalashnikova EV,Gemo AT,et al.Chromatin loading of E2F-MLL complex by cancer-associated coregulator ANCCA via reading a specific histone mark[J].Mol Cell Biol,2010,30 (22):5260-5272.
[12]Castle JC,Loewer M,Boegel S,et al.Immunomic,genomic and transcriptomic characterization of CT26 colorectal carcinoma[J].BMCGenomics,2014,(15):190.
[13]Murakami H,Ito S,Tanaka H,etal.Establishmentof new intraperitoneal paclitaxel-resistant gastric cancer cell lines and comprehensive gene expression analysis[J].Anticancer Res,2013,33 (10):4299-4307.
[14]Wan WN,Zhang YX,Wang XM,et al.ATAD2 is highly expressed in ovarian carcinomas and indicates poor prognosis[J].A-sian Pac JCancer Prev,2014,15(6):2777-2783.
[15]果海娜,李良,黃錦葉,等.乳腺浸潤性導管癌中ATAD2的表達及其臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2014,30(1):15-18.
[16]Salhia B,Kiefer J,Ross JT,et al.Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis[J].PLoSOne,2014,9(1):e85448.