傳染性造血器官壞死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表達(dá)及免疫原性

吉尚雷，張培軍，盧玉婷，王建超，李月紅

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130000)

傳染性造血器官壞死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表達(dá)及免疫原性

吉尚雷1，張培軍2，盧玉婷1，王建超1，李月紅1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130000)

【目的】 克隆傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并檢測(cè)其在大腸桿菌BL21中的表達(dá)情況，為IHNV診斷試劑盒和疫苗的研制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?設(shè)計(jì)1對(duì)G基因特異引物對(duì)G基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy 載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-G，經(jīng)雙酶切鑒定、核苷酸序列分析后，將G基因亞克隆到pET-32a(+)原核表達(dá)載體上，構(gòu)建傳染性造血器官壞死病病毒G基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】 成功克隆了IHNV G蛋白基因，該基因長(zhǎng)度為1 527 bp。成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G，誘導(dǎo)表達(dá)出約76 ku的產(chǎn)物，與預(yù)期分子質(zhì)量大小相符。Western blot分析結(jié)果顯示，所表達(dá)的G蛋白能夠被小鼠抗IHNV血清識(shí)別。間接ELISA結(jié)果顯示，小鼠抗G蛋白血清能夠識(shí)別IHNV全病毒?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建了IHNV G蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，重組G蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。

傳染性造血器官壞死病病毒；G蛋白；原核表達(dá)；免疫原性

傳染性造血器官壞死病 (Infectious haematopoietic necrosis，IHN) 是一種能引起鱒魚(yú)和鮭魚(yú)以腎臟和脾臟造血組織壞死為主要特征的嚴(yán)重傳染病[1]。該病的病原為傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，隸屬?gòu)棤畈《究浦Z拉彈狀病毒屬，為負(fù)鏈RNA病毒[2]，是彈狀病毒的典型代表[3]。IHN主要危害魚(yú)苗及種魚(yú)，死亡率可高達(dá)100%，對(duì)各國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)都有著嚴(yán)重的影響，是魚(yú)類口岸第一類檢疫對(duì)象，被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。IHN最早流行于美國(guó)西北部太平洋地區(qū)，后來(lái)在歐洲、日本也檢測(cè)到IHNV[4]。IHN于1990年在遼寧本溪大規(guī)模暴發(fā)，死亡率近100%[5]。近幾年，隨著我國(guó)鮭魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，深入研究IHNV對(duì)于IHN的檢測(cè)、預(yù)防及疫苗和診斷試劑盒的研制開(kāi)發(fā)都具有重要意義。

IHNV主要通過(guò)水平傳播感染宿主，苗種期患過(guò)IHN后殘留的帶病毒魚(yú)是主要傳染源[6]。目前還沒(méi)有有效治療IHNV的商品化藥物。糖蛋白即G蛋白，由509個(gè)氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量約為56 ku,是病毒的主要抗原[7-8]，與病毒的毒力直接相關(guān)[9]，并且在細(xì)胞受體與病毒識(shí)別結(jié)合過(guò)程中起著十分重要的作用[10-11]。為了研究吉林地區(qū)分離的IHNV CJ-13株的生物學(xué)特性，本研究對(duì)CJ-13株G蛋白基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，旨在為IHNV基因工程疫苗及快速診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與菌株

IHNV CJ-13株為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)教研室在吉林省某虹鱒魚(yú)場(chǎng)分離鑒定。胖頭鱥肌肉細(xì)胞系(FHM)、大腸桿菌BL21和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試 劑

Trizol、TaqDNA聚合酶購(gòu)于Invitrogen公司；RT-PCR相關(guān)試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、250 bp DNA ladder、即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(高)，均購(gòu)自Takara公司；彩色預(yù)染蛋白Ladder購(gòu)自NEB公司；pGEM-T Easy、pET-32a(+)載體購(gòu)自Promega公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司；弗氏不完全佐劑(FICA)購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG購(gòu)自上海生工生物工程公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

1.3 IHNV的擴(kuò)增與G基因的RT-PCR

將IHNV CJ-13株接種到單層FHM細(xì)胞，15 ℃培養(yǎng)至80%細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后，按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA。根據(jù)GenBank上發(fā)表的IHNVG基因序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)G基因特異性引物，上游引物增加了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)GAATTC，序列為：5′-TAGAATTCATGGACGCCATGATCAC-3′；下游引物增加了XhoⅠ酶切位點(diǎn)CTCGAG，序列為：5′-AATCTCGAGTTAGGACCTGTTTGCC-3′。引物擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為 1 527 bp，由上海生工生物工程公司合成。

參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，上、下游引物(40 μmol/L)各1 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，ExTaq(5 U/μL) 0.5 μL，MgCl2(50 mmol/L) 1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在-20 ℃保存，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-G的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物電泳后切下目的片段，按DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收和純化目的DNA片段。將目的片段連接到pGEM-T Easy中，反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物0.6 μL，pGEM-T Easy 1 μL，2×Rapid ligation Buffer 5 μL，T4 DNA ligase 1 μL，去離子水補(bǔ)至10 μL。4 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含0.1 mg/mL 氨芐青霉素(Amp)、0.04 mg/mL X-Gal和0.024 mg/mL IPTG的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.5 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G的構(gòu)建

分別用EcoRⅠ和XhoⅠ將序列測(cè)定正確的G蛋白基因和pET-32a(+)載體進(jìn)行雙酶切，酶切后用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。回收后的基因片段和pET-32a(+)載體片段用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建成pET-32a-G重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21，涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析

將轉(zhuǎn)化有pET-32a-G的BL21接種至含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)種于50 mL 含0.1 mg/mL Amp的 LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h至OD600值為0.7。加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)的0，1，2，3，4，5，6和7 h收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE分析[12]。

按照上述方法制備轉(zhuǎn)化有pET-32a-G的菌液300 mL，轉(zhuǎn)化有pET-32a(+)空載體的菌液200 mL。取轉(zhuǎn)化有pET-32a(+)空載體的菌液2份各100 mL，其中100 mL加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，另外100 mL不加誘導(dǎo)劑，37 ℃培養(yǎng)4 h，收集菌液作為對(duì)照組樣品。轉(zhuǎn)化有pET-32a-G的菌液加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃培養(yǎng)4 h后離心去上清，沉淀用PBS洗滌3次，加入10 mL TE，超聲破碎菌液，離心后取50 μL上清為可溶性樣品；沉淀加入10 mL TE溶解，取50 μL離心，沉淀加入50 μL蒸餾水作為包涵體樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 抗血清的制備

取本實(shí)驗(yàn)室保存的IHNV細(xì)胞毒12 mL加入40%甲醛溶液30 μL，使甲醛溶液體積分?jǐn)?shù)為 0.1%，37 ℃水浴48 h滅活病毒，加入12 mL弗氏不完全佐劑混勻，腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠注射0.5 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，血液離心后4 ℃過(guò)夜析出血清，此血清即為小鼠抗IHNV全病毒血清。同時(shí)，取經(jīng)SDS-PAGE分離的重組G蛋白，用0.25 mol/L的KCl染色，切下目的條帶加入生理鹽水充分研磨，加入等體積的弗氏不完全佐劑按照上述方法免疫小鼠，制備小鼠抗G蛋白血清。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)立對(duì)照組小鼠，腹腔注射同等劑量的生理鹽水制備陰性血清。

1.8 G蛋白免疫原性分析

重組G蛋白經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后，以小鼠抗IHNV全病毒血清(稀釋1 000倍)為一抗，HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG(稀釋2 000倍)為二抗，用DAB顯色試劑盒顯色進(jìn)行Western blot 分析。用IHNV的細(xì)胞毒包被ELISA板，以小鼠抗G蛋白血清和陰性血清為一抗，HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG為二抗，用間接ELISA試驗(yàn)測(cè)定抗G蛋白血清與病毒的反應(yīng)性，抗G蛋白血清稀釋度分別為1∶100，1∶400，1∶1 600，1∶6 400，1∶25 600。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHNV G基因的RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到了長(zhǎng)度約為1 527 bp的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 IHNVG基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
M.250 bp DNA ladder;1.G基因的RT-PCR產(chǎn)物
Fig.1 Electrophoresis analysis ofGgene RT-PCR product
M.250 bp DNA ladder;1.Product ofGgene

圖2 克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-G的酶切鑒定結(jié)果
M.250 bp DNA ladder；1.克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-G；2.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的克隆質(zhì)粒
Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEM-T Easy-G by double-digestion
M.250 bp DNA ladder;1.Recombinant plasmid pGEM-T Easy-G; 2.pGEM-T Easy-G digested withEcoRⅠ andXhoⅠ

2.2 克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-G的鑒定

克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-G用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得與G基因長(zhǎng)度一致的酶切產(chǎn)物(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符?？寺≠|(zhì)粒pGEM-T Easy-G測(cè)序結(jié)果在NCBI上與IHNV其他分離株進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示：CJ-13株G基因與ChYa07株核苷酸同源性為97.5%，氨基酸同源性為96.1%，與PcKw11株推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.8%(表1)。基于G基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)顯示，CJ-13株與韓國(guó)株ChYa07和PcKw11遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，處于同一分支上。

注：右上角為核苷酸序列同源性，左下角為氨基酸序列同源性。

Note:Nucleotide similarity in the top right,while amino acids similarity in the bottom left.

2.3 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G的鑒定

pET-32a-G質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，片段長(zhǎng)度為1 527 bp(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G測(cè)序結(jié)果與2.2節(jié)相同。

圖4 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G的酶切鑒定結(jié)果
M.250 bp DNA ladder；1.表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G；2.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的重組質(zhì)粒
Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET-32a-G by double-digestion
M.250 bp DNA ladder;1.Recombinant plasmid pET-32a-G；2.pET-32a-G digested withEcoRⅠ andXhoⅠ

2.4 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的可溶性

SDS-PAGE分析結(jié)果(圖5)顯示，pET-32a-G重組菌經(jīng)1 mmol/L IPTG、37 ℃誘導(dǎo)1～7 h均表達(dá)出了約76 ku的目的蛋白，與預(yù)測(cè)的理論分子質(zhì)量相符；在誘導(dǎo)2 h左右時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。超聲波處理誘導(dǎo)后菌體，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，重組蛋白主要在沉淀中，以不溶性的包涵體形式存在(圖6)。

2.5 IHNV重組G蛋白免疫原性分析

以重組表達(dá)的G蛋白為抗原，小鼠抗IHNV全病毒血清為一抗，HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)后的G蛋白能與小鼠抗IHNV全病毒血清反應(yīng)，在76 ku處出現(xiàn)了1條明顯的特異性條帶，與SDS-PAGE出現(xiàn)的目的蛋白一致(圖7)，表明表達(dá)的G蛋白能夠被IHNV小鼠抗血清識(shí)別， G蛋白具有良好的反應(yīng)原性。用IHNV細(xì)胞毒包被ELISA板，與小鼠抗G蛋白血清進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示小鼠抗G蛋白血清稀釋度為1∶25 600 時(shí)，P/N( P 為加陽(yáng)性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值，N為加陰性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值)值仍然大于2(表2)。這說(shuō)明小鼠抗G蛋白血清與IHNV全病毒能夠發(fā)生較強(qiáng)的反應(yīng)，鼠抗G蛋白血清能夠識(shí)別IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。

圖6 IHNV重組G蛋白的可溶性分析
M.即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(高)；1.未誘導(dǎo)的pET-32a(+)空載體；2.IPTG誘導(dǎo)的pET-32a(+)空載體；3.IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-G上清；4.IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-G沉淀
Fig.6 SDS-PAGE analysis for solubility of recombinant G protein of IHNV
M.Premixed protein Marker (High);1.pET-32a(+) vector plasmid;2.pET-32a(+) vector plasmid after being induced;3.Supernatant fluid;4.Inclusion body

圖7 IHNV重組G蛋白的Western blot分析結(jié)果
M.彩色預(yù)染蛋白Ladder；1.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物
Fig.7 Western blot analysis of expressed G protein of IHNV
M.Colorful prestained protein ladder,broad range；1.Expressed products from the recombinant plasmids

注：P為加陽(yáng)性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值，N為加陰性血清孔的OD490值-空白孔的OD490值, P/N>2,則判斷為陽(yáng)性。

Note:P means positive OD490-blank OD490,N means negative OD490-blank OD490,P/N>2 means positive.

3 討 論

IHN是一種急性、全身性、致命的傳染病，該病給全球的冷水魚(yú)業(yè)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。IHNV的主要宿主為野生、人工培育的鱒魚(yú)和鮭魚(yú)，自1990年在我國(guó)遼寧本溪發(fā)現(xiàn)第一例IHNV以來(lái)，該病的傳播趨勢(shì)不斷擴(kuò)大，對(duì)鮭魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然而，我國(guó)IHNV的研究相對(duì)比較落后，一旦爆發(fā)該病基本無(wú)法控制。因此，IHN的診斷和預(yù)防成為該病的最關(guān)鍵問(wèn)題，研制疫苗和診斷試劑盒，從根源上切斷病毒的傳播是重中之重。2013年吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)教研室從吉林省延邊自治州某漁場(chǎng)發(fā)病的虹鱒魚(yú)苗中分離到1株IHNV，命名為CJ-13，并針對(duì)G蛋白基因構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)，分析G蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性。

G蛋白是編碼抗原決定簇的主要蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和刺激細(xì)胞免疫，在免疫保護(hù)機(jī)制中起著重要的作用[13]。G蛋白直接與病毒的毒力有關(guān)。有研究顯示，在同屬?gòu)棤畈《镜目袢《局?，G蛋白上有多個(gè)抗原位點(diǎn)[14]。因此, 通常選擇G基因作為抗原基因來(lái)構(gòu)建DNA疫苗。Anderson等[15]構(gòu)建了IHNV糖蛋白重組質(zhì)粒pCMV4-G，注射虹鱒魚(yú)苗后產(chǎn)生了能夠中和IHNV的特異性抗體，從而使免疫接種的魚(yú)苗得到了保護(hù)。Kurath等[16]構(gòu)建了IHNV pIHNw-G DNA疫苗，免疫接種虹鱒魚(yú)苗3個(gè)月后可100%檢測(cè)出中和抗體，6個(gè)月后抗體水平逐漸下降。本試驗(yàn)以傳染性造血器官壞死病病毒CJ-13株G蛋白為研究對(duì)象，采用技術(shù)成熟、時(shí)間短、表達(dá)量高的原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)容易純化和易于制備抗體[17]。pET-32a(+)原核表達(dá)載體攜帶的硫氧還原蛋白融合標(biāo)簽?zāi)艽呋蜴I的形成，增加目標(biāo)蛋白的可溶性，但本試驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)蛋白是以包涵體形式存在的。筆者試圖通過(guò)降低誘導(dǎo)和培養(yǎng)溫度等條件來(lái)增加可溶性蛋白未獲得成功，其原因可能是表達(dá)系統(tǒng)中缺少某些蛋白折疊的輔助因子或者蛋白翻譯速度過(guò)快導(dǎo)致的[18]。包涵體的存在并不影響目的蛋白所具有的抗原免疫性，不影響后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

本試驗(yàn)以CJ-13株細(xì)胞毒和重組G蛋白為原料，免疫小鼠獲得了鼠抗血清，經(jīng)Western blot和間接ELISA試驗(yàn)對(duì)G蛋白的反應(yīng)原性和免疫原性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組G蛋白能夠與小鼠抗IHNV血清發(fā)生特異性反應(yīng)，顯示單一的特異性目的條帶，這說(shuō)明表達(dá)的重組G蛋白具有良好的反應(yīng)原性。用IHNV細(xì)胞毒與小鼠抗G蛋白血清進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果表明小鼠抗G蛋白血清能夠識(shí)別IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。G蛋白既能與抗體發(fā)生中和反應(yīng)，同時(shí)又能刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體，這說(shuō)明G蛋白反應(yīng)原性和免疫原性良好，尤其是免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)結(jié)果為IHNV診斷試劑盒和疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and immunogenicity of glycoprotein gene of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) CJ-13 strain

JI Shang-lei1,ZHANG Pei-jun2,LU Yu-ting1,WANG Jian-chao1,LI Yue-hong1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2JilinCenterforHealthLaboratory,Changchun,Jilin130000,China)

【Objective】 The study cloned IHNV CJ-13 strain glycoprotein gene and constructed prokaryotic expression vector for observation of expression in hostEscherichiacolistrain BL21 to provide basis for further research and development of IHNV diagnostic kit and DNA vaccine.【Method】 The surface glycoprotein of CJ-13 isolated from rainbow trout in Changchun was amplified and cloned into pGEM-T Easy vector to construct recombinants pGEM-T Easy-G and sub cloned into prokaryotic expressing vector pET-32a(+).The pET-32a-G was transformed into theE.colistrain BL21 and the expression of G protein was induced.G protein was analyzed by SDS-PAGE,Western blot and ELISA.【Result】Ggene with the length of 1 527 bp was cloned and the expressed product was about 76 ku.The G protein was identified specifically with the mouse anti-IHNV serum by Western blot analysis.ELISA results showed that IHNV could react specifically with the serum of G protein.【Conclusion】 The prokaryotic expression of IHNV G protein was constructed successfully and the expressed G protein had immunogenic and antigenic characters as native IHNV G protein.

infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV);G protein;prokaryotic expression;immunogenicity

2014-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972191)；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2014Z34)；長(zhǎng)春市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014223)

吉尚雷(1986-)，男，遼寧建昌人，碩士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。E-mail:jishanglei2008@163.com

李月紅(1968-)，女，吉林長(zhǎng)春人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物疾病與免疫研究。

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.011

S852.65+9.5

A

1671-9387(2015)07-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.011.html